一株农药降解菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物及其应用领域，具体的说，本发明涉及一种能降解农药的鞘氨醇杆菌及其应用的技术领域。
【背景技术】
[0002]20世纪60年代出现的第一次“绿色革命”为人类的粮食安全做出了重大贡献，其中农药为粮食的增产起到了重要的保障作用。由于农药具有成本低、见效快、省时省力等优点，在世界各国的农业生产中被广泛使用。然而，施用农药后仅有很少部分作用于防治对象本体、大部分都附在农作物表面或者散落在周边环境中。化学农药主要是人工合成的生物外源性物质，大多数农药本身对人类及其他生物具有毒性，加之多数农药还具有高残留、难降解的特性，更使得化学农药的使用严重威胁人类的身心健康和生态环境协调发展。农药污染是我国影响范围最大的一种有机污染，不仅污染土壤环境和农作物，而且还进一步污染到地面水体和地下水以及海洋环境，直接威胁着人类的生存环境和身体健康。我国是个农业大国，农药，尤其是化学农药的使用，依然是保证粮食作物增产、稳产的重要的和有效的手段，为了解决这个矛盾，一方面要开发高效、低毒、低残留的化学农药或生物农药，另一方面则是要找到能够高效、快速降解农药残留的方法。
[0003]农药的残留广泛分布于土壤、水体、大气及农产品中，难以利用大规模的工程措施消除。实际上，农药残留在自然界主要依靠微生物缓慢地进行降解，这虽然是依靠自然力量、不产生二次污染的理想途径，但其降解速度无法满足环境保护和治理的要求。近年来，随着对农药残留污染问题的重视，经过大量的研究，已分离到很多能降解或转化某种或几种农药的微生物类群。因此，从自然界分离和筛选具有高效降解特性的微生物并对其进行降解机理的研究，已成为当今研究的热点。
[0004]大量研究证明，自然环境中存在的多种微生物在农药降解方面起着重要的作用，科研工作者通过富集培养、分离筛选等技术已发现了许多能够降解农药的微生物。到目前为止，人们已分离了许多可降解农药的微生物，这些微生物包括细菌、真菌、放线菌和藻类。其中，对细菌的研究较为深入，其次是真菌。细菌主要有:假单孢菌属(yPseudomone^)、芽抱杆菌属{Bacillu^}、节细菌属{Arthrobac ter)、棒状杆菌属(Corynebacterim)、黄杆菌属{Flavobacteriuii)、黄单抱杆菌属、固瘤细菌属、硫杆菌属(TX1AaciWiA?)等。真菌主要有:曲霉属{Aspergillu^)、青霉属 iPenlcilliuii)、木霉属(Trichodermd)、谦刀菌属{Fusariuni)等。
[0005]微生物降解农药机理分为两类:一类是矿化作用，是指微生物直接以农药作为生长基质，将其完全分解成无机物如0)2和H20等；另一类是共代谢作用，是指微生物在有可利用碳源存在时，对原来不能利用的物质进行分解代谢的现象。农药的微生物降解途径大致分为两种:酶促途径和非酶促途径。酶促反应即微生物本身含有可降解该农药的酶系基因，通过氧化、脱氢、还原、水解、合成等作用直接作用于农药。或者，虽然不含降解该农药的酶系，但在农药胁迫下，微生物的基因发生重组或改变，产生了新的降解酶系。非酶促反应是微生物活动使环境pH发生变化而引起农药降解，或产生某些辅助因子或化学物质参与农药的转化。
[0006]目前，农药微生物降解技术研究中主要存在5个问题:(1)单一菌株的纯培养问题。在实验室内获得纯培养的菌株，然后研究它的特性、降解机理等。然而这一方法与实际情况不太符合，因为在自然状态下是多种微生物共存，通过微生物之间的共同作用来降解农药，并且农药残留往往存在于土壤、水体、农副产品等复杂环境中，即使实验室内一株菌的降解活性再强，到了这种复杂环境下有可能无法生存或起不到期望的作用。(2)受农药污染的环境及食品不能进行有效的处理。受农药污染的环境由于比较分散而且面广，很难集中统一起来处理，特别是被农药污染的食品，不能随便轻易采用微生物来处理，既要保证对农药进行降解，又要保证所使用的微生物对人体健康无害，这在目前是很难做到的，因此对食品更缺乏有效的处理方式。(3)环境条件对微生物降解农药的影响。环境条件对微生物的生长和对农药的降解影响很大，如环境中的温度、pH、水分含量、有机质含量和含氧量等变化会直接影响到微生物对农药的降解。(4)降解过程中微生物与农药接触的难易程度。对于被农药污染的土壤和水体，微生物很容易与其中的残留农药接触，从而能发挥它们的降解功能。但是，对于被农药污染的食品来说，利用微生物降解其中残留的农药很难，因为微生物无法与存在于食品内部的残留农药接触，无法发挥它们的作用。(5)微生物的适应性问题。所接种的微生物能否适应污染的环境，这不仅包括上述提到的物理环境，还涉及到生物之间的关系。接种到环境中的微生物受到抑制物的影响，或者受到包括捕食者在内的土著微生物的影响，甚至受到拮抗作用而不能生长等，这些都可以造成接种的微生物不能成为优势菌从而失去对农药的降解作用。构建多菌株复合系，具有稳定性和抗污染性强的优点，但即使是多菌混合培养的复合系也同样存在能否成为优势群体的问题。
[0007]针对上述问题，我们可以从以下几个方向去努力:(1)开发和利用农药高效降解菌，建立高效降解菌的种子库。(2)在识别微生物降解酶基因的基础上，对降解酶基因进行克隆与表达，构建工程菌、提高降解能力，制备降解酶。(3)研究特定农药微生物降解机理、代谢途径。(4)对天然的降解农药的微生物进行研究。在被农药污染的环境中可以诱导出天然的降解农药的微生物，如果采取一定措施控制条件，充分调动这些土著微生物的作用，可采用原位生物修复，而不用人为的接种微生物。
【发明内容】
[0008]针对国内外有关农药降解菌的研究现状，本发明提供一种新的农药降解菌。所述的农药降角军菌可利用 glycerol、D-galactose、L-rhamnose、D-melib1se、L-arabinose、maltose、D_raffinose，同时与该属其他菌株的16S rRNA基因序列的最高相似性95.06%至97.49% (EzTaxon)，这些特征明显区别于已公开报道的其他有效菌种。
[0009]本发明提供一株鞘氨醇杆菌Sphingobacterium griseoflavus SCU_B140o
[0010]本发明通过以不同的温度、pH值、盐浓度和培养基为富集条件，从长期施加农药农田中取样，分离纯化得到多株菌，经过多级筛选确定了一株农药降解菌(Sphingobacteriumgriseoflavus SQJ-B140)，命名为griseo/yanAs.鞘氨醇杆菌。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位:韩国典型菌种保藏中心(KCTC)，保藏时间为2014年6月26日，保藏号是KCTC 42158，KCTC地址为韩国大田市儒城区韩国生物科学和生物技术研究所，邮编是305-806。该菌为好氧菌，革兰氏阴性，细胞大小为0.4-0.6MmX 1.1-2.0Mm，菌落颜色为灰黄色。氧化酶和过氧化氢酶阳性，脲酶阴性，具有硝酸还原能力。细胞主要脂肪酸为 iso_C15:。，summed feature 3 (iso_C15:。2-OH and/or C16:1 ω 7c)和 C16:。，主要呼吸醌为MK-7，主要极性脂为磷脂酰乙醇胺(PE)，可利用碳源糊精、吐温40、吐温80、N-乙酰基-D-半乳糖苷、L-阿拉伯糖、D-纤维二糖、D-果糖、D-半乳糖、龙胆二糖、D-乳糖、乳果糖、麦芽糖、D-甘露糖、D-蜜二糖、β -甲基-D-葡萄糖苷、D-棉子糖、L-棉子糖、蔗糖、D-海藻糖、松二糖、乙酸、甘氨酰-L-谷氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸，不能利用碳源淀粉、侧金盏花醇、D-阿拉伯糖、赤藻糖醇、L-果糖、m-肌醇、D-甘露醇、阿洛酮糖、D-山梨醇、木糖醇、丙烯三羧酸、柠檬酸、甲酸、D-乳糖酸内酯、D-葡萄糖胺酸、D-葡萄糖酸、α-羟基丁酸、β-羟基丁酸、γ_羟基丁酸、Ρ-羟基苯乙酸、衣康酸、α-酮丁酸、α-酮戊二酸、D，L_乳酸、丙二酸、奎尼酸、D-葡糖二酸、癸二酸、琥珀酸、溴丁二酸、琥珀酰胺酸、葡糖醛酰胺、D-丙氨酸、L-天门冬氨酸、L-谷氨酸、甘氨酰-L-天门冬氨酸、L-组氨酸、羟基-L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-鸟氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-焦谷氨酸、D-丝氨酸、D, L-肉碱、γ -氨基丁酸、尿苷酸、肌苷、胸腺嘧啶核苷、苯乙胺、丁二胺、2-氨基乙醇、2，3-丁二醇、丙三醇、D, L-α-磷酸甘油、1-磷酸葡萄糖、6-磷酸葡萄糖。
[0011]对'威'■[取Sphingobacterium griseoflavus SQJ-B140 的形态观察、生理生化及培养特性和化学分类均按照《放线菌系统学一一方法、原理与实践》进行。其中碳源利用情况采用B1log全自动细菌鉴定系统，呼吸醌组分和细胞内G+C含量采用高效液相法来测定，使用2.5%戊二醛固定细胞后，在扫描电镜下观察该菌的形貌(图1)，参考菌株为Sphingobacterium bambusae IBFC2009 用于和测试菌株 SCU-B140 比较。
[0012]本发明通过提取总DNA、16S rRNA基因序列的扩增和测序，根据测序结果，在NCBI上用Blast进行比对分析并构建系统发育树，进一步对该菌的分类地位进行判断。
[0013]米用Sanger 法对 Sphingobacterium griseoflavus SCU-B140 的 16S rRNA 基因测序结果如下(该序列已在NCBI登记，登录号为KJ000806)，全长共1314bp:
GAGTGAGAGTGGCGCACGGGTGCGTAACGCGTGAGCAACCTGCCCATATCAGGGGGATAGCCCGGAGAAAT
CCGGATTAAGACCGCATAACACATCACCTTCGCATGGAGGCGTTGTTAAATATTTATAGGATATGGATGGGCTCGC
GTGACATTAGCTGGTTGGTGGGGTAACGGCCCACCAAGGCGACGATGTCTAGGGGCTCTGAGAGGAGAATCCCCCAC
ACTGGTACTGAGACACGGACCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAAGGAATATTGGTCAATGGGCGGAAGCCTGAAC
CAGCCATGCCGCGTGCAGGACGACTGCCCTATGGGTTGTAAACTGCTTTTGCCGGGGAATAAACCTATCTACGTGTA
GATAGCTGAACGTACCCGGAGAATAAGGATCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATCCGAGCG
TTATCCGGATTTATTGGGTTTAAAGGGTGCGTAGGCGGCACTTTAAGTCAGGAGTGAAAGACGGCAGCTCAACTGTC
GCAGTGCTCTTGATACTGAAGTGCTTGAATGCCGTTGAAGATGGCGGAATGAGACAAGTAGCGGTGAAATGCATAGA
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