一株解淀粉芽孢杆菌菌株及其菌粉制剂的制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株解淀粉芽孢杆菌菌株及其菌粉制剂的制备方法和应用，属于微生 物技术领域。
【背景技术】
[0002] 近年来，我国水产养殖业蓬勃发展，但随着高密度集约化养殖规模日益扩大，养殖 水体生态环境日益恶化，极大地增加了水产动物之间病原体交叉感染的机会。淡水鱼类细 菌性出血病是我国养鱼史上危害鱼类最严重的一种急性传染病，常导致养殖和野生鱼类的 大量死亡，造成水产养殖的严重损失。嗜水气单胞菌U. 温和气单胞菌U. soAria)、豚鼠气单胞菌（AcaKiae)是细菌性出血病主要病原体，它们存在于水、土壤、水生 动物体中，能够感染淡水主要养殖品种，如鲫、团头鲂、鲤、鳙、鲢等淡水主要养殖鱼类。其中 嗜水气单胞菌为条件致病菌，常会与温和气单胞菌、弧菌等混合感染使病情加重。近年来 南方淡水养殖鱼类流行暴发性传染病，其中许多报道系为鱼类细菌性出血病，因此，寻求安 全、高效、生态的鱼病防治方法迫在眉睫。
[0003] 针对鱼病的防治，传统的方法是使用抗生素等化学药物，由于抗生素的长期使 用容易导致病原菌的耐药性越来越强，水生动物肠道内菌群失衡，长期富集在体内通过 食物链影响人类健康等弊端，因此其在水产养殖的应用在国内外受到极大的限制。有 研究显示微生态制剂可有效控制水产养殖的各种感染性疾病，包括由迟钝爱德华氏菌 iart/a)在欧洲暢麵aiAsiraJis)中引起的爱德华氏菌病、由暢弧 菌（K/Ario 在大西洋鳕鱼中引起的疾病等。微生态制剂是一类能够抑制病 原微生物、改善养殖生态环境、调节动物体内生态平衡、增强免疫力、提高饲料利用率的有 益微生物，将微生态制剂应用于水产养殖能够有效避免服用抗生素所造成的耐药性和二次 感染等，其凭借独特的调节肠道菌群的功能而备受世人瞩目。
[0004]解淀粉芽孢杆菌（ifeciWiAsa野ioJi识/e/aciefts·)是我国农业部公告第2045号 《饲料添加剂目录2013》中淀粉酶和β-葡聚糖酶的生产菌种，也是我国免作毒理学试验的 微生物肥料安全菌种。它具有以下特点：该菌在自然界分布广泛，对人畜无毒无害，不污染 环境，生长快，稳定性好，并且其代谢产物较为丰富，具有广谱抗菌活性和较强的抗逆能力； 活菌体内的代谢产物中含有较高的淀粉酶、β-葡聚糖酶，能增加动物的体液免疫和细胞免 疫，增强机体的免疫调节活性，促进生长；可减少残饵对水体环境造成的污染，降低水体中 氮、磷的含量，从而防止水体富营养化。本发明采用低成本发酵方法获得具有多种水产病原 菌拮抗活性的高浓度解淀粉芽孢杆菌的芽孢制剂，该制剂具有环境抗逆性强、抗胃酸、抗干 燥、易贮存等独特的生物特性。
[0005]目前，解淀粉芽孢杆菌应用于淡水养殖方面的专利很少，习丙文等从大宗淡水鱼 肠道、水环境、底泥中分离筛选得到一株对嗜水气单胞菌具有拮抗作用的解淀粉芽孢杆菌 FFRC-S24,并通过培养作为益生菌添加制剂添加入饲料或药物中。该专利中的解淀粉芽孢 杆菌拮抗作用单一，对水产常见病原菌不具有广谱拮抗作用。本发明涉及解淀粉芽孢杆菌 JSSW-LA在淡水养殖中对多种水产常见病原菌有广谱拮抗作用，同时该菌株还兼具养殖环 境控制功能和提高水生动物机体免疫力的特点，是一种新型的多功能微生物。目前尚无解 淀粉芽孢杆菌此方面的专利报道。
[0006] 在淡水养殖中应用该菌株制备的微生态制剂能够尚效调控水质、防治疾病、提尚 水生动物免疫力，满足水产养殖对疾病防控、水体生态环境治理和健康养殖的高度需求。在 淡水生态健康养殖推广应用中，与传统的以药物使用为主的水质调控和病害防治技术相 比，微生态制剂具有主动预防，无毒、无残留，无污染的优点，对形成良好的养殖生态环境， 减少养殖污水的排放，消除水产品中药物的残留，保护环境具有重要意义。同时作为水产饲 料添加剂能够有效促进水产养殖动物健康生长，带动水产养殖经济效益的提高，促进水产 养殖户增产增收。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种对水产养殖常见病原菌具有拮抗作用、能够净化养殖水 体、提高水生动物免疫力的解淀粉芽孢杆菌菌株，及其菌粉制剂的制备方法和应用。
[0008] 本发明的技术方案，一种解淀粉芽孢杆菌菌株，分离自池塘底泥，该菌株的保藏名 称为：解淀粉芽孢杆菌JSSW-LA，保藏单位：中国典型培养 物保藏中心，保藏号：CCTCCNO:Μ2015602。本发明的解淀粉芽孢杆菌菌株JSSW-LA，革兰 氏阳性菌，镜检呈杆状，芽孢膨大。在LB平板上菌落直径为0. 5-1. 0mm，形态规则，表面光 滑、不透明、无色素。在LB培养基上可得大量圆形、表面光滑、不透明、白色的菌落。
[0009] 所述解淀粉芽孢杆菌菌株的菌粉制剂的制备方法，步骤如下： (1)菌种活化：无菌开启解淀粉芽孢杆菌JSSW-LA的冻干保藏菌种，划线接种于营养琼 脂试管斜面，于30-37°C培养24-48h，然后划线转接于营养琼脂茄子瓶斜面，30-37°C培养 24-48h。镜检，当90%以上菌体形成芽孢时，即为成熟；反复活化2-3次，得到种子菌悬液； 斜面培养基组成以g/L计：蛋白胨10,牛肉膏3,NaCl5，，琼脂15-20,以蒸馏水定容 配制，pH7. 0-7. 2。
[0010] (2)发酵培养：将步骤（1)所得种子菌悬液以体积比1%-10%接种量接入装有发酵 培养基的三角瓶中，三角瓶装液量为体积比10%_20%，转速为100-180rpm，30-37°C恒温振 荡培养20-24h，得到发酵液； 发酵培养基组成以g/L计：麸皮10-50,以蒸馏水定容配制，pH7. 0。
[0011]a、抑菌性测定：将无菌滤纸片在浓度约为107CFU/mL解淀粉芽孢杆菌JSSW-LA新 鲜发酵液中浸泡1. 〇h。分别取浓度约106CFU/mL的水产养殖中常见致病菌嗜水气单胞菌、 温和气单胞菌、维氏气单胞菌、豚鼠气单胞菌、爱德华氏菌、鳗利斯顿氏菌、副溶血性弧菌、 大肠杆菌、溶藻弧菌的液体培养液0. 1mL，分别涂布于LB琼脂培养基平皿上，然后将浸泡 过菌液的滤纸片贴于培养皿上，每个平皿贴3片，每个平皿做3个重复。平皿置于25-30Γ 培养箱中24、48h，测量抑菌圈大小。
[0012] b、胞外酶活性测定：将解淀粉芽孢杆菌JSSW-LA分别点种于含有脱脂牛奶、淀粉、 植物油、羧甲基纤维素钠的LB平板中，测定该菌株蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶的胞 外酶活性。于35-37Γ恒温培养24h-48h后观察，含脱脂牛奶、植物油、羧甲基纤维素钠的 平板可以直接观察水解圈；含淀粉的平板侧在观察之前滴加Ι2_ΚΙ溶液(革兰氏染色用卢 戈尔氏液)，若细菌具有淀粉酶，则淀粉被分解，不与碘发生反应，菌落周围培养基变透明， 如细菌不具有淀粉酶，则培养基中的淀粉与碘发生反应出现紫色。
[0013] (3)解淀粉芽孢杆菌菌粉制剂的制备：菌种JSSW-LA活化后经发酵培养得到的发 酵液lOOOOrpm高速离心收集湿菌体，湿菌体与干淀粉或玉米芯以质量比1:2-10进行混合， 在30-50 °C下干燥20-24h，粉碎机粉碎，过0. 9mm筛，获得的解淀粉芽孢杆菌菌粉制剂，其菌 浓度不低于5. 0X108个（CFU) /克。
[0014] 用所述方法制备的解淀粉芽孢杆菌菌粉制剂的应用，用作渔业养殖饲料的添加 剂，在饲喂基础日粮中添加1. 0-5.Omg*kg1的解淀粉芽孢杆菌菌粉制剂；用作水产养殖水 质改良剂，按50-200g/亩?米的用量全池泼洒解淀粉芽孢杆菌菌粉制剂。
[0015]本发明的有益效果：解淀粉芽孢杆菌JSSW-LA能够有效抑制温和气单胞菌、嗜水 气单胞菌、豚鼠气单胞菌、维氏气单胞菌、爱德华氏菌的生长，其中对温和气单胞菌、嗜水气 单胞菌、豚鼠气单胞菌的抑制效果优于其他种类致病菌。因此，在水产养殖中使用解淀粉芽 孢杆菌JSSW-LA制剂能够有效防控由病原菌引发的水产养殖动物病害，特别是细菌性出血 病，从而保护水生动物健康生长。
[0016]解淀粉芽孢杆菌JSSW-LA菌粉制剂作为渔业养殖饲料添加剂能够显著提高水生 动物机体免疫力。解淀粉芽孢杆菌JSSW-LA菌粉制剂作为水产养殖用水质改良剂能够有效 降低水体中的污染物含量，改善养殖水质。
[0017] 生物材料样品保藏：一株解淀粉芽孢杆菌菌株，分类命名为解淀粉芽孢杆菌 (ifeciWiAsawjioJi识/e/aciefts·)JSSW-LA，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中 国武汉武汉大学，保藏日期为2015年10月12日，保藏号：CCTCCNO:M2015602。
【附图说明】
[0018] 图1是菌株分子发育树。
【具体实施方式】
[0019] 实施例1:拮抗菌种的筛选 样品采集于无锡鹅湖青鱼池塘，称取池塘底泥l〇g于装有90mL无菌水及少量玻璃珠的 250mL三角瓶中，振荡30min，37°C培养7天。每个样品吸取1.OmL，80°C加热10min，取移液 枪吸取0.lmL于营养琼脂上，涂布，37°C培养。选取生长良好的菌落分离纯化3次，得到单 菌落。
[0020] 取指示菌（嗜水气单胞菌、温和气单胞菌）0.lmL均匀涂布于LB平板上，将上述单 菌落点种此平板，放入25-30°C恒温培养箱中培养48h，结果显示编号为JSSW-LA的菌株对 嗜水气单胞菌、温和气单胞菌均具有拮抗作用，产生明显透明抑菌圈。
[0021] 实施例2:菌种鉴定 (1)形态特征:菌株JSSW-LA，革兰氏染色为阳性，镜检呈杆状，细胞直径1-2μm，能形 成芽孢。在LB培养基上可得大量圆形、表面光滑、不透明、白色的菌落。
[0022] (2)生化特性：菌株JSSW-LA，革兰氏染色为阳性，接触酶、氧化酶、VP试验、为阳 性，能水解淀粉、明胶、酪素，能在50°C环境下生长。β-半乳糖苷酶为阴性。
[0023] 生长实验结果显示该菌株能利用α-D-葡萄糖、D-果糖、D-山梨醇、D-甘露醇、甘 油、α-D-乳糖、D-海藻糖、龙胆二糖、蔗糖、果胶，L-乳酸、柠檬酸、L-苹果酸、溴代丁二酸、L-丙氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、N-乙酰-β -D-葡糖胺反应为阳性。
[0024] 化学敏感实验结果显示，该菌株对萘啶酸、林可霉素、二甲胺四环素、夫西地酸、 十四烷硫酸钠、D-丝氨酸、万古霉素、醋竹桃霉素、利福霉素SV、丁酸钠、溴酸钠、四唑蓝、四 唑紫、氨曲南敏感，对1%乳酸钠、盐酸胍、氯化锂