一株解淀粉芽孢杆菌lx-j1及其用图
【专利说明】一株解淀粉芽孢杆菌LX-J1及其用途 【技术领域】
[0001] 本发明涉及属于微生物技术领域。更具体地，本发明涉及一株解淀粉芽孢杆菌 LX-J1，还涉及所述解淀粉芽孢杆菌LX-J1的用途。 【【背景技术】】
[0002] 花生为豆科作物，又名"落花生"或"长生果"，含油量高达50%。是主要油料经济 作物之一。花生白絹病是发生在花生上的重要病害之一，经根、荚果及茎基部受侵染后，初 呈褐色软腐状，花常常在近地面的茎基部和其附近的土壤表面先形成白色絹丝，并有油菜 籽状菌核，茎叶变黄，逐渐枯死，花生荚果腐烂。该病菌在高温高湿条件下开始萌动，侵染花 生，沙质土壤、连续重茬、密度过大不通风，阴雨天发生较重。目前对花生白絹病的防治措施 除了优选种子和轮作外，使用的药剂都是化学农药，这些化学药剂不仅破坏生态环境且易 残留。随着科学的不断发展和人们生活水平的提高，对食品安全和环保农业也提出了更高 的要求，因此新型高效的生物农药及肥料是防治植物病害将是有机农业发展的必然趋势。
[0003] 解淀粉芽孢杆菌具有生长快、适应能力强、稳定性好、代谢方式广泛的特点；具有 促进植物生长，和抑制土传性病原菌的特性，并且可对热、电磁辐射、紫外线及一些化学药 品具有很强的抗逆性，正是因为具有如此之强的抗逆性，使得其有利于生防菌剂的剂型加 工生产，因此解淀粉芽孢杆菌是作为农用微生物具有较高开发价值的生防菌。 【
【发明内容】
】
[0004] [要解决的技术问题]
[0005] 本发明的目的是提供一株解淀粉芽孢杆菌LX-J1。
[0006] 本发明的另一个目的是提供所述解淀粉芽孢杆菌LX-J1的用途。
[0007] [技术方案]
[0008] 本发明是通过下述技术方案实现的。
[0009] 本发明涉及一株解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens) LX-J1，该菌株 于2015年8月21日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No. 11263。
[0010] 根据本发明的一种优选实施方式，所述的解淀粉芽孢杆菌LX-J1的培养方法的步 骤如下：
[0011] A、斜面培养
[0012] 使用接种环挑取一环保存于甘油管中的解淀粉芽孢杆菌LX-J1接种于斜面培养 基斜面上，然后置于恒温培养箱中在温度28~30°C的条件下斜面培养40~48小时；
[0013] B、种子培养
[0014] 将一环在步骤A得到的斜面培养物接种到液体种子培养基中，然后置于恒温培养 箱中在温度28~30°C与转速180rpm的条件下培养6h~10h，得到种子培养物；
[0015] C、发酵培养
[0016] 按照以发酵培养基体积计5~10 %接种量，将在步骤B得到的种子培养物转接 至发酵培养基中，再置于发酵培养罐中，先在温度28~30°C、转速150~200rpm、风量 1:1. 0~1. 2与罐内压力0. 04~0. 08MPa的条件下培养15h，接着在温度30~35°C与转 速320~380rpm的条件下继续发酵培养至40 - 45h，发酵结束后得到的发酵培养物含有 100~120亿/ml解淀粉芽孢杆菌LX-J1。
[0017] 根据本发明的另一种优选实施方式，所述斜面培养基的制备方法如下：
[0018] 将5~10g牛肉膏、1~5g氯化钠、5~10g蛋白胨与20g琼脂溶于水中，再用水 补充到总体积l〇〇〇ml，然后使用无机酸或无机碱将得到的溶液pH值调节至pH 7. 0~7. 2。
[0019] 根据本发明的另一种优选实施方式，所述液体种子培养基的制备方法如下：
[0020] 将5~10g牛肉膏、1~5g氯化钠与5~10g蛋白胨溶于水中，再用水补充到总体 积1000ml，然后使用无机酸或无机碱将得到的溶液pH值调节至pH 7. 0~7. 2。
[0021] 根据本发明的另一种优选实施方式，所述发酵培养基的制备方法如下：
[0022] 将15~20g淀粉、1~3g玉米衆粉、1~5g蛋白胨、1~5g氯化钠、1~5g Κ2ΗΡ04 · 3H20、1~3g NH4C1与0· 1~0· 5g MgS04 · 7H20溶于水中，再用水补充到总体积 1000ml，然后使用无机酸或无机碱将得到的溶液pH值调节至pH 7. 0~7. 5。
[0023] 根据本发明的另一种优选实施方式，所述的无机酸选自盐酸或磷酸；所述的无机 碱选自氢氧化钠、氢氧化钾或氨水。
[0024] 本发明还涉及一种解淀粉芽孢杆菌LX-J1制剂的生产方法。
[0025] 该生产方法的步骤如下：
[0026] 往所述的解淀粉芽孢杆菌LX-J1发酵液中添加以金属离子重量计为0. 1~0. 5% 的硫酸铜、1~2%的硫酸锌、0. 1~0. 5%的硫酸锰及0. 1~0. 6%黄原胶，得到所述的解淀 粉芽孢杆菌LX-J1制剂。
[0027] 本发明还涉及采用所述生产方法生产得到的解淀粉芽孢杆菌LX-J1制剂。每毫升 解淀粉芽孢杆菌LX-J1制剂含有100亿以上个解淀粉芽孢杆菌LX-J1。
[0028] 本发明还涉及所述的解淀粉芽孢杆菌LX-J1制剂在防治禾谷丝核菌、立枯丝核 菌、终极腐霉、白絹病菌与马铃薯黑痔病中的用途。
[0029] 下面将更详细地描述本发明。
[0030] 本发明涉及一株解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens) LX-J1，该菌株 于2015年8月21日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No. 11263。
[0031] 一、分离筛选
[0032] 从河南驻马店花生种植地块采集土壤样品，依照五点取样法在地块四周和中央在 深度10~20cm范围内分别采取100g土壤，将这些土壤等量混勾，得到一种土样。称取10g 土样溶于90ml水中，在振荡培养箱中在温度28°C与转速180rpm的条件下振荡20min，分离 得到浓度为10 2g/ml的悬浮液。
[0033] 移取100 μ 1悬浮液放于装有900 μ 1水的离心管中，充分振荡混勾，制成10 3g/ml 的悬浮液，再依次用水稀释至10 7或10 sg/ml悬浮液。分别移取100 μ 110 7或10 sg/ml悬 浮液，均匀涂布在倒有PDA固体培养基（20g葡萄糖、200g去皮马铃薯、18g琼脂粉与1000ml 蒸馏水，pH7. 0)的平板中，同时在平板上按照每个平板中心接种一个花生白絹病菌菌核，接 着放到温度25°C培养箱中倒置培养4d，观察并挑选拮抗抑制圈大的菌落。
[0034] 二、纯化
[0035] 让在步骤一挑选的菌落在NA培养基（蛋白胨10g/L,牛肉膏5g/L，氯化钠5g/L， 琼脂20g/L)上再次划线纯化，挑取单菌落点接种于上述PDA培养基上，在培养基上接种花 生白絹病菌进行拮抗验证，并且挑取具有相同菌落形态的单菌落接种于NA培养基上，划线 保存。
[0036] 三、菌株鉴定
[0037] ①菌体形态特性：革兰氏阳性菌，杆状，在NA培养基上培养12h以上可产生芽孢， 具体参见附图1。
[0038] ②菌落形态特性：在NA培养基上培养至菌落3mm时菌落形态为圆形、有凸起、表面 有褶皱，边缘呈波状不透明白色菌落，具体参见附图2。
[0039] ③分子生物学鉴定（16s rDNA序列扩增及序列测定）：
[0040] 样品总DNA制备：米用常规细菌DNA提取方法进行。
[0041] PCR引物：正向引物27F :AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG ;反向引物 1492r :TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T〇
[0042] PCR反应体系：20 μ 1反应体系，反应液组成：1 μ 1 DNA模板、10 μ 12XMastarMix、 0·4μ1 27F、0.4yl 1492R，超纯水补足至 20μ1。
[0043] PCR扩增程序：在温度94°C为2min ;30个循环（在温度94°C为lmin，在温度52°C 为lmin，在温度65°C为8min);在温度65°C为18min。
[0044] 扩增产物经0. 7%琼脂糖凝胶电泳检测正确后测序，测序结果利用blast软件进 行同源性比对，该菌株与解淀粉芽孢杆菌的同源性为99%，结合菌落特征、菌体形态特征及 分子生物学特性，鉴定该分离菌为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)。解淀 粉芽孢杆菌CGMCC No. 11263菌株的16S rRNA基因序列测定结果见附录1。
[0045] 该菌株命名为解淀粉芽孢杆菌LX-J1，它已于2015年8月21日