一株生防用解淀粉芽孢杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株生防用解淀粉芽孢杆菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 芽孢杆菌（Bacillus spp.)是内生芽孢的革兰氏阳性细菌，是目前生防细菌 中研究较多的一类，因其能够产生耐热、耐旱、抗紫外线和有机溶剂的内生孢子，是理 想的生防菌筛选对象。研究表明，目前应用于防治植物病害的芽孢杆菌属细菌有枯 草芽孢杆菌（B. subtilis)、解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌 (B. licheniformis)等。植物根际土壤作为受植物活根影响的土壤微区，含有大量的微生 物，包括真菌、细菌、放线菌、藻类、原生动物等。在植物根际微生物中，细菌生长快，也最常 见，并且种类繁多，在土壤营养元素循环、有机物质的形成和分解、肥力的保持和提高、生态 环境的改善、植物的生长发育等方面均起着极其重要的作用，被认为是良好的有益微生物 资源库。近些年来，利用土壤中的有益细菌及其代谢产物防治植物病害更是成为国内外研 究的热点。
【发明内容】
[0003] 本发明提供了一株生防用解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)及其 应用。
[0004] 本发明的解淀粉芽孢杆菌采集自北京农学院，命名为TR2,已于2014年10月30日 保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国 科学院微生物研究所），保藏编号为CGMCC No. 9875。TR2菌落为圆形或近圆形，白色，边缘 不光滑，表面有明显褶皱
[0005] 本发明的解淀粉芽孢杆菌具有针对植物病原真菌的抑菌活性。所述植物病原真菌 为立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、胶孢炭疽菌、拟盘多毛孢菌、美澳型核果褐腐病菌、富克葡萄孢 盘菌、葡萄座腔菌、茄病镰孢菌、芸薹链格孢菌。
[0006] 本发明的解淀粉芽孢杆菌可用于制备针对植物病原真菌的生防菌剂或微生物菌 肥。
[0007] 其中，所述植物病原真菌为立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、胶孢炭疽菌、拟盘多毛孢菌、 美澳型核果褐腐病菌、富克葡萄孢盘菌、葡萄座腔菌、茄病镰孢菌、芸薹链格孢菌。
[0008] 本发明还提供了针对植物病原真菌的生防菌剂微生物菌肥，其中所述生防菌剂的 活性成分为本发明的解淀粉芽孢杆菌。
[0009] 其中，所述植物病原真菌为立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、胶孢炭疽菌、拟盘多毛孢菌、 美澳型核果褐腐病菌、富克葡萄孢盘菌、葡萄座腔菌、茄病镰孢菌、芸薹链格孢菌。
[0010] 本发明的解淀粉芽孢杆菌具有对植物病原真菌的抑菌活性并且具有较宽的抑菌 谱。
【附图说明】
[0011] 图1显示三株菌的菌落形态，
[0012] 其中，左：DJ1，中：TR2,右：ZT4-2。
[0013] 图2显示淀粉酶检测结果，
[0014] 其中，左上：ZT4-2,右上：TR2,左下：DJ1，右下：E. coli JM109。
[0015] 图3显示蛋白酶检测结果，
[0016] 其中，左上：ZT4-2,右上：TR2,左下：DJ1，右下：E. coli JM109。
[0017] 图4显示纤维素酶检测结果，
[0018] 其中，上：ZT4-2,中右：TR2,下：DJ1，中左：E. coli JM109。
[0019] 图5显示脂肪酶检测结果，
[0020] 其中，左：DJ1，中：ZT4-2，右：TR2。
[0021] 图6显示葡萄糖发酵检测结果，
[0022] 其中，由左至右依次为对照、TR2、ZT4-2和DJ1。
[0023] 图7显示蔗糖发酵检测结果，
[0024] 其中，由左至右依次为对照、TR2、ZT4-2和DJ1。
[0025] 图8显示乳糖发酵检测结果，
[0026] 其中，由左至右依次为对照、TR2、ZT4-2和DJ1。
[0027] 图9显示甘露醇发酵检测结果，
[0028] 其中，由左至右依次为对照、TR2、ZT4-2和DJ1。
[0029] 图10显示肌醇发酵检测结果，
[0030] 其中，由左至右依次为对照、TR2、ZT4-2和DJ1。
[0031] 图11显示革兰氏染色结果
[0032] 其中，由左至右依次为 ZT4_2、TR2、DJ1 和 E.coli JM109。
[0033] 图12显示芽孢染色结果
[0034] 其中，由左至右依次为ZT4-2、TR2和DJ1。图13显示16SrDNA的扩增的电泳图，
[0035] 其中，Μ 为分子量 Marker，1. ZT4-2,2. TR2,3. DJ1。
[0036] 图14显示gyrA基因的扩增的电泳图，
[0037] 其中，Μ 为分子量 Marker，1. ZT4-2 ;2· TR2 ;3· DJ1。
[0038] 图15显示鞭毛蛋白基因的扩增的电泳图，
[0039] Μ 为分子量 Marker，1. ZT4-2 ;2· TR2 ;3· DJ1。
【具体实施方式】
[0040] 实施例1.菌株ZT4-2、DJ1、TR2的分离及鉴定
[0041] (一）菌株ZT4-2、DJ1、TR2 的分离
[0042] 采集来自北京地区的不同植物根际的土样，土样具体信息见表1。土样采自植物根 际土壤10cm处，样品采集后置于密封袋中，实验室4°C冰箱保存。称取土壤样品10g，放入 盛有90mL无菌水的三角瓶中，振荡约20min。取土壤悬浮液lmL逐级稀释至10 7倍，分别 取10 5、10 6、10 7浓度的土壤悬浮液均匀地涂于NA平板上，每个浓度梯度重复3皿，在27°C 恒温下培养1~2d。从平板上挑取不同培养性状的单菌落，继续在ΝΑ平板上划线纯化，获 得细菌纯培养，给菌株编号并保存。
[0043] 表1 土样米集?目息
[0045] 三株细菌的菌落形态如图1所示，菌株DJ1的菌落为圆形或近圆形，白色，边缘不 光滑，表面有明显褶皱。菌株TR2的菌落形态和DJ1比较相似，菌落为圆形或近圆形，白色， 边缘不光滑，表面有明显褶皱。菌株ΖΤ4-2的菌落形态为圆形或近圆形，白色，平铺，边缘不 整齐，表面褶皱较少。
[0046] (二）菌株 ZT4_2、DJ1、TR2 的鉴定
[0047] 1菌株ΖΤ4-2、DJ1、TR2生理生化鉴定
[0048] 1. 1淀粉酶的检测
[0049] 检测培养基：淀粉酶选择培养基（LB培养基+1. 0%可溶性淀粉）：蛋白胨10g，酵 母膏5g，NaC15g，可溶性淀粉10g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH7. 8。
[0050] 检测方法：取 10 μ L 摇培的待测菌株（ZT4-2、TR2、DJ1 和 E. coli JM109, E. coli JM109为大肠杆菌对照菌株，不具有淀粉水解酶活性）滴加到检测平板上，晾干后28°C恒温 培养24-48h，然后用稀碘液覆盖染色，清水冲洗，观察透明圈大小。
[0051] 检测结果：如图2所示，可以看出，在三个菌株ZT4_2、TR2和DJ1的周围都有透明 圈产生，说明它们都能产生淀粉酶，淀粉水解阳性。E. coli JM109的周围无透明圈产生菌 株，不具有淀粉水解酶活性。
[0052] 1.2蛋白酶检测
[0053] 检测平板：含10 %的脱脂牛奶水琼脂培养基（琼脂粉，lg/100mL水），选用三元脱 脂牛奶，先微波炉加热，如果有脂肪膜则去掉，再用移液枪吸取10mL加到100mL已灭菌冷凉 的水琼脂培养基内。
[0054] 检测方法：将待测菌株（ZT4_2、TR2、DJ1和E. coli JM109)在NA培养基中摇培过 夜，取10 μ L滴加到检测平板上，晾干后28°C恒温培养，12h后观察蛋白降解圈。
[0055] 检测结果：如图3所示，从图3可以看出，在三个菌株ZT4_2、TR2和DJ1的周围都 有较明显的透明圈产生，说明它们都能产生蛋白酶，蛋白酶水解阳性。E. co 1 i JM109的周围 也有较明显的透明圈产生，也具有一定的蛋白水解酶活性。
[0056] 1. 3纤维素酶检测
[0057] 检测平板：半LB培养基（碳源、氮源的量减半），加0. 2%的羧甲基纤维素钠。
[0058] 检测方法：将待测菌株（ZT4-2、TR2、DJ1和E. coli JM109)在NA培养基中摇培过 夜，取10 μ L滴加到检测平板上，晾干后于28°C恒温培养24h，洗掉菌落，加入lg/L刚果红 溶液染色lh，然后用1M NaCl溶液浸泡洗涤2次进行脱色，每次浸泡30min，观察菌落周围 有无纤维素水解圈。
[0059] 检测结果：如图4所示，可以看出，在三个菌株ZT4_2、TR2和DJ1的周围都能产生 白色透明圈，说明它们都能产生纤维素酶，纤维素酶水解阳性。E. coli JM109菌株的周围也 能产生白色透明圈，也具有纤维素水解酶活性。
[0060] 1. 4脂肪酶检测
[0061] 检测培养基：油脂培养基：蛋白胨l〇g、牛肉膏5g、花生油或香油10g、1.6%中性红 水溶液lmL、琼脂15g、蒸馏水1000mL、pH7. 2。
[0062] 检测方法：配制油脂培养基，灭菌后备用。倒平板前，将油脂培养基充分震荡使油 脂均匀分布，再倒入培养皿中。平板凝固后将待测