一种解淀粉芽孢杆菌菌株及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种解淀粉孢杆菌菌株HY?05，分类命名为巨大芽孢杆菌(Bacillus amyliquefaciens),于2015年11月20日送至中国武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM2015697。HY?05菌株，对连作土地和病害严重土地中的病原菌有很好的生物防治功能，HY?05菌株的不断繁殖能够抑制病原菌的繁殖，改善土壤微生物群落结构，提高作物抗逆性，增加作物产量，减少化学药剂的使用量，保护生态环境，促进农业持续发展，具有很好的推广价值。
【专利说明】
一种解淀粉芽孢杆菌菌株及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种解淀粉芽孢杆菌菌株及其在防治土传 疾病方面的应用。
【背景技术】
[0002] 随着农业产业结构调整，以温室、大棚为主的设施农业发展迅速，由于多种原因作 物重茬日益严重，有些保护地集中的地区，连续几年甚至十几年连续栽种同种作物，导致土 传病害十分严重，土传病害是以土壤为媒介进行传播的植物病害的统称，指生活在土壤中 的病原体，如真菌、细菌、线虫和病毒等在条件适宜时从作物根部或茎部侵害作物而引起的 病害。我国土传病害种类很多，常见的土传病害有立枯病、枯萎病、黄萎病、软腐病以及根腐 病、青枯病、菌核病等，作物生长前期一旦发生病害，幼苗根腐烂或是茎腐烂猝倒，幼苗很快 就会死亡，严重影响作物生产。典型的如腐霉菌(Pythium spp.)引起苗腐和猝倒病、丝核菌 引起苗立枯病；象尖孢镰(Fusarium oxysporum)、黄萎轮枝孢(Verticillium alboatum)等 引起的萎蔫、枯死。作物生长后期发生病害，一般年份减产20-30%，严重年份减产50-60%， 甚至绝收。土传病害病原物大多习居或半习居于土壤中，在土壤中存活方式多样，寄主范围 广，具有传染性，一旦单价发生很难根除，防治较为困难，通常会给农业生产造成重大的经 济损失，成为制约农业可持续发展的主要因素。
[0003] 目前常规的防治方法为筛选抗病品种和化学药物防治，但是只对个别特殊病害有 效，整体防治效果不高，而且使用化学药剂会破坏土壤生态平衡，连同有益微生物也一并杀 死了，在土壤中很可能诱发更有害甚至更危险的病菌，没有有益微生物的存在，就有可能导 致病害愈来愈严重，还会产生药物残留、环境污染等问题。而采用换土等方法，动用大量人 力，把表层土与下层土进行置换，其情况类同土壤消毒，也只能缓解当年病害。不能根本解 决问题。而且成本巨大。生物防治是目前最合理、最环保、最生态的防治方法，也是较为有效 的防治方法，简单讲就是以菌治菌。通过持续施用有益微生物，促使其不断繁殖，扩大区系、 抑制、消灭有害菌。理论和实践都证明了这是从根本上防治土传病害，解决作物重茬、可持 续发展农业生产的最佳途径。
[0004]因此，开发一种能有效防治土传病害，调控土壤微生物群落结构，提高作物抗逆 性，减少化学药剂使用，减少环境污染的新型微生物菌剂迫在眉睫。
【发明内容】
[0005] 本发明目的是提供一种解淀粉芽孢杆菌菌株及其在防治土传疾病中的应用。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是:一种解淀粉芽孢杆菌菌株，其 特征是所述解淀粉芽孢杆菌菌株的株名为HY-05,分类命名为巨大芽孢杆菌（Bacillus 811^119116€3(^6118)，于2015年11月20日送至中国武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏号 为CCTCCM2015697。
[0007] 上述解淀粉芽孢杆菌菌株，其筛选过程包括以下步骤：
[0008] 1)菌株纯化:预备LB (Lur ia-Bertani)培养基：向950ml蒸馏水中加入蛋白胨lOg， 酵母膏5g，NaCl 10g，调pH值7.0，定容至1000ml;
[0009] 马铃薯培养基(PDA培养基）：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂15~20g，水1000ml，自然 pH;将去皮的马铃薯切成块煮沸半小时，用纱布过滤后加蔗糖及琼脂，融化后补足水至 1000ml;通过梯度稀释并涂布，从样品土壤中分离细菌。通过三区划线法对分离到的细菌进 行纯化并编号;细菌分离及培养用121°C高压蒸汽灭菌20min的LB培养基和马铃薯培养基； 通过分离纯化，将得到菌株，根据不同的菌株形态特征分别标记为HY-01、HY-02、……；
[0010] 2)拮抗菌株的筛选:采用菌斑抑制法，在空白培养基中央周围对角线打四个直径 为10mm小孔，移去培养基，分别接入棉花大丽轮枝孢、水稻立枯丝核菌、棉花枯萎病原菌、天 门冬茎点霉菌四种不同的病原菌;在中间点接种分离纯化的菌株，放入28°C培养。逐日记录 菌株与四种病原菌生长情况以及拮抗抑制情况;使用菌斑抑制法，测定抑菌圈直径以后，筛 选出抑菌圈最大的菌株，然后对筛选出的菌株继续做抑菌实验，每株菌株设3个重复平行， 将平板放置培养，72h后测定抑菌圈的直径，直至选出拮抗效果最好的菌株。
[0011] 通过分离纯化，共得到48株不同形态的菌株，根据不同的菌株形态特征分别标记 为HY01-HY48。使用菌斑抑制法，筛选出4株抑菌圈最大的4株菌株，编号分别为取-05、取-17、HY-21、HY-32。然后对4株筛选出的菌株继续做抑菌实验，每株菌株设3个重复平行，将平 板放置培养，72h后测定抑菌圈的直径。结果显示，加入芽孢杆菌HY-05的平板抑菌圈直径最 大，从而可以说明，本发明筛选到芽孢杆菌中HY-05的抑菌效果最强。
[0012] HY-05革兰氏染色呈阳性，长杆状，产芽孢，有荚膜，稀疏周生鞭毛。在LB平板上培 养24h后，形成单菌落类圆形，边缘不规则，有隆起，表面褶皱，不透明，干燥，菌落呈浅黄色； 液体培养静止时有菌膜形成。显微镜镜头下观察，呈杆状，有运动性。
[0013]对HY-05进行生理生化鉴定表明：菌株的接触酶、酪朊水解、厌氧生长、明胶水解、 淀粉水解、V-P反应和硝酸盐还原均为阳性;酪氨酸水解、苯丙氨酸脱氨酶、吲哚产生、柠檬 酸盐利用均为阴性;可利用D-葡萄糖、D-甘露醇、麦芽糖、蔗糖。经观察可知，菌株在pH5.6条 件下生长;5%NaCl下不生长;在50°C下不生长。通过NCBI数据库进行对比，HY-05菌株的遗 传进化距离与芽孢杆菌属最近，它与解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)同处 于一个最小的分支，与已知菌株Bacillus amyloliquefaciens同源性达到99%，综合HY-05 菌株的形态特征和16SrDNA序列分析，鉴定HY-05菌株为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)〇
[0014]本发明中土壤样品来自武汉合缘绿色公司生产种植基地，从连作土地和病害发生 严重的土地作物根系周围采集;病原菌选取棉花大丽轮枝孢、水稻立枯丝核菌、棉花枯萎病 原菌、天门冬茎点霉菌为代表，均由华中农业大学植保系提供。
[0015] 本发明所提供的解淀粉芽孢杆菌HY-05菌株，对连作土地和病害严重土地中的病 原菌有很好的生物防治功能，HY-05菌株的不断繁殖能够抑制病原菌的繁殖，改善土壤微生 物群落结构，提高作物抗逆性，增加作物产量，减少化学药剂的使用量，保护生态环境，促进 农业持续发展，具有很好的推广价值。
【附图说明】
[0016] 图1是HY-05菌落形态图。
【具体实施方式】
[0017] 下面将结合本发明的附图和实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述， 显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的 实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都 属于本发明保护的范围。
[0018] HY-05菌株的筛选过程包括以下步骤：
[0019] 1)菌株纯化:预备LB (Lur ia-Bertani)培养基：向950ml蒸馏水中加入蛋白胨10g， 酵母膏5g，NaCl 10g，调pH值7.0，定容至1000ml;
[0020]马铃薯培养基(PDA培养基）：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂15~20g，水1000ml，自然 pH;将去皮的马铃薯切成块煮沸半小时，用纱布过滤后加蔗糖及琼脂，融化后补足水至 1000ml；
[0021]通过梯度稀释并涂布，从样品土壤中分离细菌;通过三区划线法对分离到的细菌 进行纯化并编号；细菌分离及培养用121°C高压蒸汽灭菌20min的LB培养基和马铃薯培养 基;通过分离纯化，将得到菌株，根据不同的菌株形态特征分别标记为HY-01、HY-02、……。
[0022] 2)拮抗菌株的筛选:采用菌斑抑制法，在空白培养基中央周围对角线打四个直径 为10mm小孔，移去培养基，分别接入棉花大丽轮枝孢、水稻立枯丝核菌、棉花枯萎病原菌、天 门冬茎点霉菌四种不同的病原菌;在中间点接种分离纯化的菌株，放入28°C培养。逐日记录 菌株与四种病原菌生长情况以及拮抗抑制情况;使用菌斑抑制法，测定抑菌圈直径以后，筛 选出抑菌圈最大的菌株，然后对筛选出的菌株继续做抑菌实验，每株菌株设3个重复平行， 将平板放置培养，72h后测定抑菌圈的直径，直至选出拮抗效果最好的菌株。
[0023] 图1是HY-05菌落形态图。
[0024]将解淀粉芽孢杆菌HY-05菌株进行分子生物学鉴定，测得其16SrDNA序列，测序结 果如下:AGCTCTGTCACCTTCGGCGGCTGGCTCCAAAGGTT ACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTG ATACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGAT CCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTT GCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATT GGCTTACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCAT TGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCAAGGGGCATGATGAT TTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCA GTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGA CAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTC ACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACT CTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAG AGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCG AATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGT CAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCA GGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGC GaAAACCCCCTACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTG GACACCAGGGCTACCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTC CTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCAC TGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACAC GTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCA GTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCA CATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCC AATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGC GGCTGCTGGCACGAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGT ACCGTCAAGGTGCCGCCCTTGAACGGCACTTGTTCTTCC CTACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTC ACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAA GATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTG TCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGC TACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACT AGCTAGCGCCGCGGGTCCCTGAAGTGGAGCCGAAGCCAC CTTTGTCTGAACCATGCGG。
[0025]以下是HY-05的抑菌效果实验：
[0026] 1 .HY-05的菌液制备：
[0027]将解淀粉芽孢杆菌HY-05接种于营养肉汤培养基中，37°C，200rpm培养12h;
[0028] 2 ?病原菌制备：
[0029]将棉花大丽轮枝孢、水稻立枯丝核菌、棉花枯萎病原菌和天门冬茎点霉菌4种病原 菌的菌块接于PDA固体培养皿90mm)中央，28 °C培养7d;
[0030] 3 ?抑菌实验
[0031] 取步骤2中4种病原菌菌块10mm)分别置于PDA固体培养皿（〇90mm)的中央，用 直径60mm的无菌空白平皿的边缘蘸取解淀粉芽孢杆菌HY-05菌液后，在上述TOA固体培养皿 中的病原菌块周围进行环形接种。空白对照组用无菌水进行环形接种。将接种后的PDA固体 培养皿置于28°C培养箱中，分别在培养72h、96h、120h、144h时测量病原菌的直径，利用下列 公式计算抑菌率，具体结果见表1。
[0032] 抑菌率（％ ) = (1_(处理组病原菌直径-空白组病原菌直径））X 100
[0033]表1解淀粉芽孢杆菌HY-05对病原菌的抑菌效果
[0034]
[0035] 从表1可以看出，本发明筛选出的解淀粉芽孢杆菌HY-05能显著抑制棉花大丽轮枝 孢、水稻立枯丝核菌、棉花枯萎病原菌和天门冬茎点霉菌的繁殖，且在培养120h时抑菌率基 本达到峰值，抑菌率均在57 %以上，效果显著。
[0036] 2014年，武汉市土肥站在江夏区开展解淀粉菌剂在大棚番茄上的防病试验，研究 其在大田连作条件下对番茄土传病害的防控效果、增产幅度和品质改善的作用。试验效果 表明：施用后能显著降低土传病害的发生;不施的对照发病率为37.5%，施用生物菌剂处理 后发病率仅为5.8 %，防效达85.3 %。番茄产量:对照3645千克/亩;处理产量5214千克/亩， 而且施用有机肥的番茄口感好，耐贮藏。
[0037] 武汉市土壤肥料站在江夏区开展了解淀粉芽孢杆菌在水稻上田间试验，研究其在 大田自然条件下对水稻的增产效果、抗病虫害和施肥的影响。结果表明，施用后，全程没有 施用任何农药，病害发生较轻，并不会导致明显的减产现象，且对水稻有明显的增产作用， 每667m2增产22kg，增产率5.74 %，可促进水稻苗的生长和分蘖。
[0038]最后，应当指出，以上【具体实施方式】仅是本发明较有代表性的例子。显然，本发明 不限于上述【具体实施方式】，还可以有许多变形。凡是依据本发明的技术实质对以上具体实 施方式所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均应认为属于本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种解淀粉芽孢杆菌菌株，其特征是所述解淀粉芽孢杆菌菌株的株名为HY-05，分类 命名为巨大芽孢杆菌(Bacillus amyliquefaciens)，于2015年11月20日送至中国武汉的中 国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM2015697。2. 根际权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌菌株，其筛选过程包括以下步骤： 1) 菌株纯化:预备LB(Luria-Bertani)培养基：向950ml蒸馏水中加入蛋白胨10g，酵母 膏5g，NaCl 10g，调pH值7 · 0，定容至 1000ml; 马铃薯培养基(PDA培养基）：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂15~20g，水1000ml，自然pH;将 去皮的马铃薯切成块煮沸半小时，用纱布过滤后加蔗糖及琼脂，融化后补足水至l〇〇〇ml;牛 肉膏蛋白胨培养基(NA培养基）：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂15-20g，水1000ml，pH值 7.0~7.2;通过梯度稀释并涂布，从样品土壤中分离细菌。通过三区划线法对分离到的细菌 进行纯化并编号；细菌分离及培养用121°C高压蒸汽灭菌20min的LB培养基和马铃薯培养 基;通过分离纯化，将得到菌株，根据不同的菌株形态特征分别标记为HY-01、HY-02、……； 2) 拮抗菌株的筛选：采用菌斑抑制法，在空白培养基中央周围对角线打四个直径为 10mm小孔，移去培养基，分别接入棉花大丽轮枝孢、水稻立枯丝核菌、棉花枯萎病原菌、天门 冬茎点霉菌四种不同的病原菌;在中间点接种分离纯化的菌株，放入28°C培养。逐日记录菌 株与四种病原菌生长情况以及拮抗抑制情况;使用菌斑抑制法，测定抑菌圈直径以后，筛选 出抑菌圈最大的菌株，然后对筛选出的菌株继续做抑菌实验，每株菌株设3个重复平行，将 平板放置培养，72h后测定抑菌圈的直径，直至选出拮抗效果最好的菌株。3. 根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌菌株，其特征是所述解淀粉芽孢杆菌菌株的 16SrDNA 序列为:A GCTCTGTCACCTTCGGCGGCTGGCTCCAAAG GTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGT GTGATACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCT GATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGA GTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGG ATTGGCTTACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTC CATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCAAGGGGCATGAT GATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCG GCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTA AGACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACAT CTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTC ACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGT CAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCT TCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCC CGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCC CCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGG GGCGaAAACCCCCTACACTTAGCACTCATCGTTTACGGC GTGGACACCAGGGCTACCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCG CTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGC CACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTA CACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCC CCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTT TCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACG CCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTAC CGCGGCTGCTGGCACGAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTA GGTACCGTCAAGGTGCCGCCCTTGAACGGCACTTGTTCT TCCCTACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCA CTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCG GAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCC GTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTC GGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCA ACTAGCTAGCGCCGCGGGTCCCTGAAGTGGAGCCGAAGC CACCTTTGTCTGAACCATGCGG。
【文档编号】C12R1/07GK105820969SQ201610030782
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年1月15日
【发明人】徐维烈, 杨涛, 杨国平, 熊峰, 徐辉, 袁庆丰
【申请人】武汉合缘绿色生物股份有限公司