一种巨大芽孢杆菌菌株及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种巨大芽孢杆菌菌株，菌株号为HY?09，分类命名为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium),于2015年11月20日送至中国武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM2015698。该菌株具有很好的IAA产量，能够促进植物吸收土壤中的有益元素，改善土壤微环境，抑制病源菌的繁殖，提高肥效和肥料吸收率，提高作物的产量和品质，具有很好的经济效益和社会效益。
【专利说明】
一种巨大芽孢杆菌菌株及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种巨大芽孢杆菌菌株及其在促进植物生 长中的应用。
【背景技术】
[0002] 植物根际促生菌(Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)指生存于植物 根际、根表，并直接或间接地促成或调节植物生长的微生物，不仅能提高根际养分有效性， 还能通过分泌 n引噪乙酸（Indole-3-acetic acid, IAA)促进植物生长。IAA是产生调节植物 生长素的信号物质，是在植物体内普遍存在的生长素，对植物生长起着关键的作用，可增加 植物根的生长及分布，有利于根从土壤中吸收更多的营养物质。细菌不仅通过分泌IAA，而 且还通过固氮、溶磷、溶铁，并产生植物激素，如生长素、赤霉素、细胞分裂素和乙烯等，提高 作物抗逆性，抑制土壤病原菌和增加土壤有益微生物等多种途径达到对植物的促生作用。
[0003] 巨大芽孢杆菌是一种植物根际促生菌，其在生长繁殖过程中能产生大量的有机 酸，可将土壤中难溶的含磷物质分解或溶解，并转化成易被植物吸收的磷元素，提高磷元素 的利用率，改善土壤微生态环境:减轻病害、降低农药残留:施入土壤后，迅速繁殖成为优势 菌，控制根际的营养和其他资源，致使病源菌在相当程度上丧失生存空间和条件;使植物有 关组织细胞壁增厚、纤维化、木质化程度提高，并在表皮层外形成角质双硅层，形成一道阻 止病菌侵袭的屏障，提高肥效:通过把无效磷转化为有效磷，有效提高土壤中磷的吸收率。 分离和筛选多功能和高效的巨大芽孢杆菌菌株，可以丰富微生物肥料菌种资源，拓宽微生 物肥料在改善土壤养分和土壤生态，促进植物生长、耐盐抗逆等功能，提高作物的产量和品 质，促进农业的可持续发展，减少环境污染和保障人类健康，具有重要的实践意义。
【发明内容】
[0004] 本发明目的是提供一种巨大芽孢杆菌菌株及其在促进植物生长中的应用。
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是:一种巨大芽孢杆菌菌株，其特 征是所述巨大芽孢杆菌菌株号为HY-09,分类命名为巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium)，于2015年11月20日送至中国武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏号为 CCTCCM2015698。
[0006] 上述巨大芽孢杆菌菌株，其筛选过程包括以下步骤：
[0007] 1)菌株的分离纯化:称取10g根际土壤，用无菌水漂洗三次，再置于盛有100ml灭菌 水的250ml三角瓶中，于30°C、200rpm下震荡30min，静置lOmin，得到根际土壤悬浮液；向 950ml去离子水加入蛋白胨10g、酵母膏5g、NaC110g，摇动容器直至溶质溶解，用5mol/L NaOH溶液调pH至7.0,用去离子水定容至1000ml，在15psl高压下蒸汽灭菌21min。向每 100011111^培养基内加入10-15克琼脂粉，通过倒板制成1^(1^11^3-1^1^311；〇平板 ;将根际土 壤悬浮液稀释至1〇4、1(^5、1(^6，每个稀释度取〇.11111分别涂布于1^平板上，30°(：倒置培养 24h，挑取不同类型的典型菌落，分离纯化后4°C斜面保藏；
[0008] 2)菌株的筛选:采用含有L-色氨酸（200mg/L)的R2A液体作为筛选培养基;将纯化 后的菌株接种于筛选培养基，于30°C，180rpm摇床培养2d;取50ul菌悬液滴于白色陶瓷板 上，同时加50ulSalkowski比色液;将加入50ul50mg/L IAA的比色液作为阳性对照，白色陶 瓷板于室温(20°C)避光放置30min后观察，颜色变红者表示能够分泌IAA;对初筛获得的分 泌IAA的菌株进行定量测定，培养条件同上。将菌悬液在lOOOOrpm下离心10min，取上清液加 入等体积Salkowski比色液，避光静置30min测定其OD53Q值。每株菌设置3个平行，标准曲线 采用分析纯的IAA梯度稀释，按照同样的方法测定0D值绘制，选取IAA产量最高的菌株，利用 平板划线法纯化后保存于营养琼脂的斜面培养基上。
[0009]通过分离纯化，共分离出28株菌株;通过对产IAA的菌株的定性筛选，筛选出12株， 将产IAA的菌株分别编号，编号按HY-01、HY-02、…、HY-12命名，并分别用L-色氨酸发酵培养 48h，测定发酵液中IAA含量，其中巨大芽孢杆菌HY-09菌株的IAA产量最高，达到27.59mg/L。 将筛选出的HY-09菌利用平板划线法纯化后，保存于营养琼脂的斜面培养基上。
[0010] 对巨大芽孢杆菌HY-09菌株进行生理生化指标测定，显示菌株呈革兰氏阳性、产芽 孢的不规则杆状。菌落较小为白色、隆起，边缘整齐，表面光滑湿润，不透明；严格好氧，化能 异养。最适生长温度为30°C。接触酶阳性，M.R和VP试验阴性，淀粉水解阳性，明胶水解阳性， 硝酸盐还原阳性，柠檬酸盐利用阳性。
[0011] 进一步地，对巨大芽孢杆菌HY-09菌株进行16SrRNA基因序列测序，测序结果如下：
[0012] 本发明所提供的巨大芽孢杆菌HY-09菌株，具有很高的IAA产量，能够促进植物吸 收土壤中的有益元素，改善土壤微环境，抑制病源菌的繁殖，提高肥效和肥料吸收率，提高 作物的产量和品质，具有很好的经济效益和社会效益。
【附图说明】
[0013] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本 发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以 根据这些附图获得其他的附图。
[0014] 图1是从根际土壤中筛选得到的HY-09菌落形态图。
【具体实施方式】
[0015] 下面将结合本发明实施例及其附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于 本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例，都属于本发明保护的范围。
[0016] 图1是从根际土壤中筛选得到的HY-09菌落形态图。
[0017]巨大芽孢杆菌菌株HY-09菌株，其筛选过程包括以下步骤：
[0018] 1)菌株的分离纯化:称取10g根际土壤(该土壤样品来自湖北省农科院蔬菜研究所 所种植的黄瓜大棚），用无菌水漂洗三次，再置于盛有l〇〇ml灭菌水的250ml三角瓶中，于30 °C、200rpm下震荡30min，静置lOmin，得到根际土壤悬浮液；向950ml去离子水加入蛋白胨 l〇g、酵母膏5g、NaC110g，摇动容器直至溶质溶解，用5mol/L NaOH溶液调pH至7.0,用去离子 水定容至1〇〇〇1111，在15口81高压下蒸汽灭菌21111；[11。向每100011111^培养基内加入10-15克琼脂 粉，通过倒板制成LB(L Uria-Bertani)平板;将根际土壤悬浮液稀释至10-4、10-5、10- 6,每个 稀释度取0.1ml分别涂布于LB平板上，30°C倒置培养24h，挑取不同类型的典型菌落，分离纯 化后4°C斜面保藏；
[0019] 2)菌株的筛选:采用含有L-色氨酸(200mg/L)的R2A液体作为筛选培养基;将纯化 后的菌株接种于筛选培养基，于30°C，180rpm摇床培养2d;取50ul菌悬液滴于白色陶瓷板 上，同时加50ulSalkowski比色液;将加入50ul50mg/L IAA的比色液作为阳性对照，白色陶 瓷板于室温(20°C)避光放置30min后观察，颜色变红者表示能够分泌IAA;对初筛获得的分 泌IAA的菌株进行定量测定，培养条件同上。将菌悬液在lOOOOrpm下离心10min，取上清液加 入等体积Salkowski比色液，避光静置30min测定其OD53Q值。每株菌设置3个平行，标准曲线 采用分析纯的IAA梯度稀释，按照同样的方法测定0D值绘制，选取IAA产量最高的菌株，利用 平板划线法纯化后保存于营养琼脂的斜面培养基上。
[0020] 为了验证巨大芽孢杆菌HY-09菌株对植物促进生长的效果，进行以下几个实验。
[0021]菌液制备:将本发明的HY-09菌株通过液体发酵24h得到菌液，芽孢计数20亿/ml。 [0022] 1)促黄瓜生长试验
[0023] 选取规格一致花盆(240 X160mm)80个，将草炭、蛭石、珍珠岩按3:1:1混匀后装盆， 自来水浇透，放置2d。将黄瓜种子每盆点种3粒，出土后定苗，选取长势一致的幼苗，分别用 稀释度为〇 . 25 %、0.5%和1.0 %的菌液灌根，灌根量为100ml，对照为无菌水，每组处理20 盆。菌液处理15d后，分别测定株高、径粗、叶宽、干重。测量结果见表1。
[0024]表1不同处理下黄瓜幼苗的株高、径粗、叶宽、干重
[0027]从表1可以看出，本发明筛选出的巨大芽孢杆菌HY-09对黄瓜幼苗有明显的促生长 作用，并且在0.5%稀释度的使用下效果最好。
[0028] 2)促花生生长试验
[0029] 选取规格一致花盆(240 X 160mm) 10个，米集自然条件下0~20cm的土壤，过5mm筛 装盆，自来水浇透，放置2d。将花生种子用20%双氧水进行表面消毒20min，无菌水冲洗多 次，催芽2d，选取发芽一致的种子备用。将本发明的HY-09菌株制成的菌液（20亿/ml)，按 0.5 %的稀释度稀释后均匀喷洒至其中5个花盆，喷洒量为50ml。另外5个花盆作为对照，喷 等量的无菌水。播种30d后，测定株高、主根长、地上鲜重以及地下鲜重。结果见表2.
[0030] 表2接种HY-09菌株菌液对花生植株的影响
[0032]由表2可以看出，接种了HY-09菌株土壤生长的花生，植株的株尚、主根长、地上鲜 重以及地下鲜重较参考都有明显的增长趋势。
[0033] 3)促小麦生长试验
[0034]发芽率试验:选取6个培养皿（150mm)，皿内铺上3层湿润的滤纸。在每个培养皿里 放200粒小麦种子，其中3皿用稀释度为0.5 %的HY-09菌株制备的菌液拌种，其余3皿作为对 照，用等量无菌水拌种，记录几天内小麦的发芽情况。发芽率见表3。
[0035]表3使用HY-09菌株菌液拌种对小麦发芽率的影响
[0038]从表3可以看出，在第5天小麦发芽率基本达到峰值，并且用HY-09菌株制备的菌液 摔种后，对小麦的发芽率有一定的提升。
[0039]幼苗促生长试验:选取6个培养皿(90mm)，采集自然条件下0~20cm的土壤，过5mm 筛装皿，每皿65g，自来水浇透，放置2d。将小麦种子使用HY-09菌株制备的菌液拌种，催芽 3d，选取发芽一致的种子播到3个培养皿里，每皿20粒。对照采用无菌水拌种发芽。播种后， 记录5d内小麦的苗长生长情况。记录结果见表4。
[0040]表4使用HY-09菌株菌液拌种对小麦幼苗的影响
[0042] 由表4可知，使用HY-09菌株菌液对小麦进行拌种后，幼苗的生长明显优于参考组。
[0043] 结合以上试验的对比结果，可以看出，本发明的巨大芽孢杆菌菌株不仅对黄瓜、花 生等经济作物有促生长的作用，对小麦等大田作物同样有用。因而具有很好的实用价值。 [0044]最后，应当指出，以上【具体实施方式】仅是本发明较有代表性的例子。显然，本发明 不限于上述【具体实施方式】，还可以有许多变形。凡是依据本发明的技术实质对以上具体实 施方式所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均应认为属于本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种巨大芽孢杆菌菌株，其特征是所述巨大芽孢杆菌菌株为HY-09,分类命名为巨大 芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，于2015年11月20日送至中国武汉的中国典型培养物保 藏中心，保藏号为CCTCCM2015698。2. 根际权利要求1所述的巨大芽孢杆菌菌株，其特征是该巨大芽孢杆菌菌株的筛选过 程包括以下步骤： 1) 菌株的分离纯化:称取l〇g根际土壤，用无菌水漂洗三次，再置于盛有l〇〇ml灭菌水的 250ml三角瓶中，于30 °C、200rpm下震荡30min，静置lOmin，得到根际土壤悬浮液；向950ml去 离子水加入蛋白胨l〇g、酵母膏5g、NaCl 10g，摇动容器直至溶质溶解，用5mol/L NaOH溶液 调pH至7.0，用去离子水定容至1000ml，在15psl高压下蒸汽灭菌21min。向每lOOOmlLB培养 基内加入10-15克琼脂粉，通过倒板制成LB(Luria-B ertani)平板;将根际土壤悬浮液分别 稀释10-4、10-5、1〇Λ每个稀释度取0.1ml分别涂布于LB平板上，30°C倒置培养24h，挑取不同 类型的典型菌落，分离纯化后4°C斜面保藏； 2) 菌株的筛选:采用含有L-色氨酸（200mg/L)的R2A液体作为筛选培养基;将纯化后的 菌株接种于筛选培养基，于30°C，180rpm摇床培养2d;取50ul菌悬液滴于白色陶瓷板上，同 时加50ulSalkowski比色液;将加入50ul50mg/LIAA的比色液作为阳性对照，白色陶瓷板于 室温(20 °C)避光放置30min后观察，颜色变红者表示能够分泌IAA;对初筛获得的分泌IAA的 菌株进行定量测定，培养条件同上。将菌悬液在l〇〇〇〇rpm下离心10min，取上清液加入等体 积Salkowski比色液，避光静置30min测定其OD53Q值。每株菌设置3个平行，标准曲线采用分 析纯的IAA梯度稀释，按照同样的方法测定0D值绘制，选取IAA产量最高的菌株，利用平板划 线法纯化后保存于营养琼脂的斜面培养基上。3. 根据权利要求1所述的巨大芽孢杆菌菌株，其特征巨大芽孢杆菌菌株的16SrRNA基因 序列测序结果为:T GGCGGCTGCTCGGCGGCTGGCTCCAAAGGT TACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGT GATACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGA TCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGT TGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGAT TGGCTTACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCA TTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCAAGGGGCATGATGA TTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGC AGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAG ACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCT CACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCAC TCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCA GAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTC GAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCG TCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCC AGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGG CGaAAACCCCCTACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGT GGACACCAGGGCTACCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCT CCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCA CTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACA CGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCC AGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTC ACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCC CAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCG CGGCTGCTGGCACGAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGG TACCGTCAAGGTGCCGCCCTTGAACGGCACTTGTTCTTC CCTACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACT CACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGA AGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGT GTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGG CTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAAC TAGCTAGCGCCGCGGGTCCCTGAAGTGGAGCCAAGGTGA CAGGAAATG。
【文档编号】C12N1/20GK105820970SQ201610030783
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年1月15日
【发明人】徐维烈, 杨涛, 杨国平, 熊峰, 徐辉, 袁庆丰
【申请人】武汉合缘绿色生物股份有限公司