一种解淀粉芽孢杆菌及其应用
【专利摘要】本发明提供了一株解淀粉芽孢杆菌WZS01。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2016096，保藏时间日期是为2016年3月8日，保藏单位是中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉，武汉大学，邮编430072。该菌株经过一次培养后，可以用于催化三氯蔗糖制备中蔗糖?6?乙酸酯合成和三氯蔗糖?6?乙酸酯水解两个步骤，并且具有反应条件温和，反应选择性好，产物单一，转化率高等优点。本发明为生物法制备三氯蔗糖提供了新的途径。CCTCC NO：M 201609620160308
【专利说明】
一种解淀粉芽孢杆菌及其应用
技术领域
[0001]本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种解淀粉芽孢杆菌及其应用。
【背景技术】
[0002]三氯蔗糖，又称作4，I’，6’ -三氯半乳蔗糖，是唯一以蔗糖为原料的功能性甜味剂，甜度为蔗糖的600倍左右。三氯蔗糖具有无能量、甜度高、甜味纯正、安全等特点，是目前最优秀的功能性甜味剂之一，己被包括中国在内的30多个国家批准作为甜味剂，并在食品领域广泛使用。
[0003]合成三氯蔗糖的方式有化学法和酶一化学法。化学法如使用全基团保护法的美国专利US 4617269，使用单基团保护法的美国专利US 4889928、US 5449772、US 4889928和US5449772。化学合成法产物收率较高，但是反应条件较苛刻、生产成本较高、反应选择性较差、容易产生副产物。酶-化学法是利用酶的立体专一性和催化活性，使基团反应发生在所需要的位置，如将蔗糖中葡萄糖分子上的6位羟基以酶法酰基化保护，再经氯代、脱酰基、分离等步骤合成三氯蔗糖。美国专利US 4617269和GB 2145080A公布了由葡萄糖和蔗糖生物法制备蔗糖-6-乙酸酯的方法，摩尔产率50%左右。中国专利CN 101268090A公布了利用能够产生果糖基转移酶类的微生物(如等)全细胞生物催化葡萄糖-
6-乙酸酯转化为蔗糖-6-乙酸酯的方法，产率为45%左右。美国专利US 4826962以棉籽糖为原料，经选择性氯化后，用来源于vinacea，Circinella m u s c a e或Aspergillus fiige的a_半乳糖苷酶，水解去除棉籽糖中的乳糖基制得三氯鹿糖，摩尔产率70%左右。该方法虽然摩尔产率高，但是大量的棉子糖原料较难得到。美国专利US 5141860公布了制备酰基蔗糖衍生物的方法，将一些脂肪酶、酯酶、淀粉酶、半乳糖苷酶、蛋白酶用于蔗糖乙酸酯的选择性水解，进一步氯化后脱酯，可以得到三氯蔗糖，但是这些反应过程步骤较多，酶用量大，且反应时间长，产物中混合物和异构体较多。中国专利CN 101886100A使用诺维信商品化的固定化脂肪酶Lipozyme TLIM在叔丁醇-二甲基亚砜(体积比4:1)体系中，催化蔗糖与乙酸乙烯酯进行转酯反应，30°C反应6小时，摩尔产率达到89%。然而使用商品化脂肪酶成本较高。另外本发明使用叔丁醇-二甲基甲酰胺(体积比4:1)作为反应介质，在与上述专利CN 101886100A相同底物浓度的情况下，产物的摩尔产率可以达到95.6%。反应体系中的二甲基甲酰胺无需去除，因为三氯蔗糖制备的下一步反应，即蔗糖-6-乙酸酯的氯化步骤需要在二甲基甲酰胺中进行。
[0004]在氯化步骤完成后，三氯蔗糖乙酸酯需要脱去乙酰基团生成三氯蔗糖。关于三氯蔗糖单酯的脱保护反应，专利US5023329、US5128248、US5470969、CN1176094C均是在甲醇溶液中，使用甲醇钠或者氢氧化钠做催化剂进行反应。然而该反应向体系中引入了大量的钠离子，乙酰基脱除后，还需要将钠离子用阳离子交换树脂从溶液中交换出来。而使用本发明的技术，则无需这一操作，从而降低了三氯蔗糖的生产成本。
[0005]事实上，已有使用酶法水解三氯蔗糖-6-乙酸酯，得到三氯蔗糖的报道。Ratnam等报道了在生产三氯蔗糖过程中，使用固定化酶，脱乙酰化率最高达到95%，但仍然需要纯化。Chaubey等使用节杆菌和枯草芽孢杆菌水解三氯蔗糖-6-乙酸酯，底物浓度1-2%，水解48h，转化率达到100%，因而无需后续纯化步骤。本发明与该报道相比，优势在于底物浓度更高，水解时间更短，底物浓度3.5%，水解24h，产率99.6%。
[0006]本发明最大的优势在于，使用同一菌种，经过一次培养，作为全细胞催化剂，以较高的催化效率进行三氯蔗糖制备过程中的酯化和水解反应，极大地简化了酶法合成三氯蔗糖的操作步骤。
【发明内容】
[0007]针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种解淀粉芽孢杆菌及其应用的技术方案。
[0008]所述的一种解淀粉芽孢杆菌amyloliquefaciens)^ZSOl，保藏号为CCTCC Ν0:Μ 2016096，保藏时间日期是为2016年3月8日，保藏单位是中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉，武汉大学，邮编430072。
[0009]所述的一种解淀粉芽孢杆菌在三氯蔗糖合成过程中催化蔗糖-6-乙酸酯合成的应用。
[0010]所述的应用，其特征在于以蔗糖和乙酸乙烯酯作为底物，叔丁醇作为反应介质，吸附有解淀粉芽孢杆菌的聚氨酯泡沫作为催化剂进行反应生成蔗糖-6-乙酸酯。
[0011]所述的应用，其特征在于所述的吸附有解淀粉芽孢杆菌的聚氨酯泡沫通过以下步骤得到:将加入了重量体积比为0.6?1.0%密度为1?50Kg/m3的聚氨酯泡沫的培养基进行灭菌，冷却后接种1%的解淀粉芽孢杆菌种子液，30°C培养18?24小时后干燥得到。
[0012]所述的应用，其特征在于所述的培养基包括葡萄糖2.0?3.5%、蛋白胨0.5?1.5%、酵母粉0.1%0
[0013]所述的应用，其特征在于向反应体系中加入重量体积比1.0?2.5%干燥后的吸附有解淀粉芽孢杆菌的聚氨酯泡沫，控制反应温度30?38°C，反应时间16?24小时。
[0014]所述的一种解淀粉芽孢杆菌在三氯蔗糖合成过程中催化三氯蔗糖-6-乙酸酯水解的应用。
[0015]所述的应用，其特征在于以三氯蔗糖-6-乙酸酯作为底物，甲醇作为三氯蔗糖-6-乙酸酯的助溶剂，含有解淀粉芽孢杆菌的湿菌体或干燥后的吸附有菌体的聚氨酯泡沫为催化剂，在PH5.1?8.0的缓冲体系中进行水解生成三氯蔗糖。
[0016]所述的应用，其特征在于向反应体系中加入重量体积比3?5%的湿菌体或重量体积比1.0?2.0%干燥后的吸附有菌体的聚氨酯泡沫，控制反应温度30?400C，反应时间12?24小时。
[0017]所述的一种解淀粉芽孢杆菌在三氯蔗糖合成过程中催化蔗糖-6-乙酸酯合成和催化三氯蔗糖-6-乙酸酯水解的应用。
[0018]本发明中筛选到的菌株可以用于催化三氯蔗糖制备中蔗糖-6-乙酸酯合成和三氯蔗糖-6-乙酸酯水解两个步骤。并且具有反应条件温和，反应选择性好，产物单一，转化率高等优点。本发明为生物法制备三氯蔗糖提供了新的途径。
【具体实施方式】
[0019]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
[0020]实施例1蔗糖-6-乙酸酯合成菌株的筛选和鉴定
蔗糖-6-乙酸酯合成过程中释放乙醛，使用Zheng等(2014)的显色方法，可以对乙醛定量，从而反映出酶活力的大小。将0.1g土样加入20ml含橄榄油的液体富集培养基中，加入20ml含橄榄油的液体富集培养基中，30°C，180 r/min，振荡培养48小时。稀释后涂布于含有三丁酸甘油酯和溴百里香酚蓝的初筛平板上，30°C培养两天。挑取菌落颜色变为黄色的不同形态的单菌落，液体培养后，吸取Iml于离心管中，离心，吸净上清，烘干菌体，加入含10%蔗糖的DMF 0.2mL，叔丁醇0.8mL，0.056mL乙酸乙烯酯，30°C反应I小时；取20倍稀释的反应液ΙΟΟμΙ，加入ΙΟΟμΙ 0.1% 酚试剂，反应lOmin，再加入40μ1 1% NH4Fe(S04)2.12Η20 试剂，反应30min;酶标仪测定0D598。将上述筛选到的菌种，培养后进行蔗糖_6_乙酸酯催化反应，液相测定产物谱。
[0021 ]将筛选到的菌粉溶于无菌水，在LB和Yro平板培养基上复活。提取该菌的总DNA，使用引物(5 ’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3 ’ 和5 ’ -AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3 ’)为上下游引物扩增待鉴定菌株的16S rDNA。通过BLAST程序比对，仅能鉴定出该菌为芽孢杆菌。进一步使用上下游引物(
5’-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3’ 和
5 ’ -AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3 ’)扩增的部分序列。测序后，通过BLAST程序比对，并结合该菌的系统发生树，发现该菌株与解淀粉芽孢杆菌菌株h47在亲缘关系上最接近。将该菌株命名为解淀粉芽孢杆菌WZS01，已经保存于保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC N0:M2016096o
[0022]
实施例2培养基的优化
以葡萄糖2.0%、蛋白胨2.0%、酵母粉0.1%为出发培养基。分别按2%的浓度以乳糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、甘油为碳源。30 0C培养24h，取0.2ml培养物干燥后进行反应，Iml反应体系，反应30分钟，按上述菌株筛选的显色方法，测定相对反应初速度。葡萄糖为碳源时，相对反应初速度显著高于其他碳源。进一步考察了葡萄糖浓度对菌株WZS01的产酶的影响。葡萄糖浓度2%、2.3%、3%、3.5%的相对反应初速度之比分别为0.8:1:0.99:0.77。
[0023]当碳源为2.5%葡萄糖时，本实验选择添加1%的有机氮源(牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、玉米粉)或无机氮源(硫酸铵、硝酸钠、氯化铵)，考察不同氮源对菌株WZS01产酶的影响，发现蛋白胨为氮源时，相对反应初速度高于其他氮源。进一步考察了蛋白胨浓度对菌株WZSOI的产酶的影响。蛋白胨浓度为0.5%、1%、1.5%的相对应初速度之比分别为0.57:1:0.77。
[0024]
实施例3菌体不同培养时间对摩尔产率的影响
将加入了 0.8%(重量体积比)的聚氨酯泡沫(密度10Kg/m3)的培养基(2.5%葡萄糖、1%蛋白胨、0.5%酵母)进行灭菌，冷却后接种1%的解淀粉芽孢杆菌WZSOI种子液，30 °C培养15、18、21、24小时。将吸附有菌体的聚氨酯泡沫干燥后，使用比色法测得上述培养时间的蔗糖-6-乙酸酯合成反应初速度之比为0.83:l:0.92:0.64o
[0025]
实施例4将吸附菌体的聚氨酯泡沫用于蔗糖-6-乙酸酯的合成
I)在25mL的具塞单□反应烧瓶中，称取0.2g干燥的吸附有菌体的聚氨酯泡沫，含10%蔗糖的DMF 2mL，叔丁醇8mL，乙酸乙烯酯0.56mL，32°C反应18小时;吸附有菌体的密度为1Kg/m3、30Kg/m3、50Kg/m3聚氨酯，摩尔产率分别为83.3%、57.1%和21.2%。0.2g干燥的游离菌体在相同条件下，催化该反应，蔗糖-6-乙酸酯的摩尔转化率仅为17.0%。
[0026]2)在251^的具塞单口反应烧瓶中，分别称取0.18、0.158、0.28、0.258吸附有菌体的聚氨酯泡沫，含10%蔗糖的DMF 2mL，叔丁醇8mL，乙酸乙烯酯0.56mL，32°C反应18小时，摩尔产率分别为 36.1%、55.2%、83.3%、81.9%。
[0027]3)在25mL的具塞单口反应烧瓶中，称取0.2g吸附有菌体的聚氨酯泡沫，含10%蔗糖的DMF 2mL，叔丁醇8mL，乙酸乙烯酯0.56mL，在30、32、34、36、38°C反应12小时，摩尔产率分别为 54.6%、73.0%、67.5%、62.3%、58.3%。
[0028]4)在25mL的具塞单口反应烧瓶中，分别称取0.2g吸附有菌体的聚氨酯泡沫，含10%蔗糖的DMF 2mL，叔丁醇8mL，乙酸乙烯酯0.56mL，在32°C反应16、18、20、22、24小时，HPLC检测蔗糖-6乙酸酯含量，摩尔产率分别为78.8%、83.3%、90.6%、95.6%、92.8%。
[0029]
实施例5解淀粉芽孢杆菌WZSOI用于三氯蔗糖-6-乙酸酯的水解
(I)在25mL的具塞单口反应烧瓶中，湿菌体3%、4%、5%，甲醇含量20%，底物三氯蔗糖-6-乙酸酯3.5%，25mM磷酸盐缓冲液pH7.1，在36 °C反应2h，HPLC检测三氯蔗糖含量，相应的摩尔产率分别为31.1%、45.5%、44.9%。
[0030](2)在25mL的具塞单口反应烧瓶中，湿菌体4%，甲醇含量15%、20%、25%，底物三氯蔗糖-6-乙酸酯3.5%，25mM磷酸盐缓冲液pH7.1，在36°C反应2h，HPLC检测三氯蔗糖含量，相应的摩尔产率分别为44.9%、45.5%、39.5%。
[0031](3)在25mL的具塞单口反应烧瓶中，湿菌体4%，甲醇含量20%，底物三氯蔗糖-6-乙酸酯3.5%，25mM磷酸盐缓冲液pH7.1，在30、32、34、36、38、40 °C反应2h，HPLC检测三氯蔗糖含量，相应的摩尔产率分别为31.4%、33.2%、37.8%、44.7%、41.9%、32.1%。
[0032](4)在25mL的具塞单口反应烧瓶中，湿菌体4%，甲醇含量20%，底物三氯蔗糖-6-乙酸酯浓度3.5%，25mM磷酸盐缓冲液pH5.1、6.3、7.1、7.8、8.0，36°C反应4h，HPLC检测三氯蔗糖含量，相应的摩尔产率分别为21.8%、61.6%、76.1%、73.3%、66.0%。
[0033](5)在25mL的具塞单口反应烧瓶中，湿菌体4%，甲醇含量20%，25mM磷酸盐缓冲液(pH7.1)，底物三氯蔗糖-6-乙酸酯浓度1.0%、3.5%、5.6%，36 °C反应16h，HPLC检测三氯蔗糖含量，相应的摩尔产率分别为96.9%、93.8%、64%。
[0034](6)在25mL的具塞单口反应烧瓶中，湿菌体4%，甲醇含量20%，25mM磷酸盐缓冲液(pH7.1)，底物三氯蔗糖-6-乙酸酯浓度3.5%，36°C反应12、16、20、24h，HPLC检测三氯蔗糖含量，相应的摩尔产率分别为93.2%、94.5%、96.4%、99.6%。
[0035](7)在25mL的具塞单口反应烧瓶中，使用重量体积比I.0%、1.5%、2.0%干燥后的吸附有菌体的聚氨酯泡沫作为三氯蔗糖-6-乙酸酯水解反应的催化剂，甲醇含量20%，25mM磷酸盐缓冲液(PH7.1)，底物三氯蔗糖-6-乙酸酯浓度3.5%，36°C反应16h，HPLC检测三氯蔗糖含量，相应的摩尔产率分别为82.2%、84.5%、88.4%。
[0036]
实施例6蔗糖-6-乙酸酯的纯化和鉴定
将Ig蔗糖溶于50mL溶剂(DMF:叔丁醇=1:4(V/V))，加入0.8g吸附有解淀粉芽孢杆菌WZSOl的聚氨酯泡沫，2.8 mL乙酸乙烯酯，32°C反应24h。反应结束后离心，取上清。60°C低压蒸馏去除叔丁醇，向得到的含有蔗糖6酯的DMF溶液加入4倍体积的二氯甲烷，离心收集沉淀，即为蔗糖-6-乙酸酯粗品，纯度86.1%。
[0037]取0.4g粗品用硅胶G层析柱纯化，洗脱液为乙腈:甲醇:水=8:1:1 (V/V)，流速为0.8mL/min，收集流出液，60 °C下真空浓缩，得到0.15g蔗糖-6-乙酸酯，纯度为96%。
[0038]对上述产物进行结构确定:
红外光谱分析(KI压片法):3392.81C-0H)，2924.90(烷烃饱和C-H)，1729.35(C=0)，1253.88(酯基C-0)，1046.28(C_0_C)，927.97(α-糖苷键)。
[0039]核磁共振波分析13C 图谱结果:13C 匪 R(400MHz，C2D6SO): 170.85 (-C0CH2),103.91 (C2，)， 91.58 (Cl), 82.75 (C5’)，77.12 (C3，)， 74.66 (C4，)， 72.88 (C3),71.63 (C2), 70.34 (C5), 70.17 (C4), 63.95 (C，)，62.74 (C6，)，62.43 (Cl，)，20.84 (-C0CH2)。
[0040]上述图谱符合蔗糖-6-乙酸酯的结构特征。
[0041]
实施例7三氯蔗糖的纯化和鉴定
将2g三氯蔗糖-6-乙酸酯溶于50mL溶剂(甲醇:pH7.0磷酸缓冲液=1:4(V/V))，加入湿重I.6g解淀粉芽孢杆菌WZSOI菌体，36°C反应24h。反应结束后离心，取上清，用旋转蒸发仪在60°C下真空去除甲醇和水，烘干，得到黄色固体结晶，纯度98.6%，未检测到三氯蔗糖6乙酸酯。
[0042]对上述产物进行结构确定:
红外光谱分析(KI压片法):3398.61 (-0H)，2924.19(烷烃饱和C-H)，1088.82(C-0-C)，919.03、862.27、739.22(C-Cl)。与蔗糖-6-乙酸酯的红外谱图相比，羰基C=0、酯基C-O的吸收峰均消失了，这两处变化证实了6位上的乙酰基已经脱除成功。
[0043]核磁共振波分析13C图谱结果:13C NMR (400 MHz, D2O) δ, 104.03 (C2，)，93.36(Cl), 81.81 (C5，)， 77.04 (C3，)， 76.17 (C4，)， 71.24 (C5), 68.88 C3), 68.50(C2), 63.99 (C4), 62.25 (C6), 58.37 (s), 50.01 (s), 45.75 (C6，)， 44.59 (Cl)。
[0044]上述图谱符合三氯蔗糖的结构特征。
【主权项】
1.一种解淀粉芽抱杆菌amyloliquefaciens)^ZSOl，保藏号为CCTCCNO:M2016096。2.如权利要求1所述的一种解淀粉芽孢杆菌在三氯蔗糖合成过程中催化蔗糖-6-乙酸酯合成的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于以蔗糖和乙酸乙烯酯作为底物，叔丁醇作为反应介质，吸附有解淀粉芽孢杆菌的聚氨酯泡沫作为催化剂进行反应生成蔗糖-6-乙酸酯。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的吸附有解淀粉芽孢杆菌的聚氨酯泡沫通过以下步骤得到:将加入了重量体积比为0.6?1.0%密度为10?50Kg/m3的聚氨酯泡沫的培养基进行灭菌，冷却后接种1%的解淀粉芽孢杆菌种子液，30 °C培养18?24小时后干燥得到。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述的培养基包括葡萄糖2.0?3.5%、蛋白胨0.5 ?1.5%、酵母粉 0.1%。6.如权利要求4所述的应用，其特征在于向反应体系中加入重量体积比1.0?2.5%干燥后的吸附有解淀粉芽孢杆菌的聚氨酯泡沫，控制反应温度30?38°C，反应时间16?24小时。7.如权利要求1所述的一种解淀粉芽孢杆菌在三氯蔗糖合成过程中催化三氯蔗糖-6-乙酸酯水解的应用。8.如权利要求7所述的应用，其特征在于以三氯蔗糖-6-乙酸酯作为底物，甲醇作为三氯蔗糖-6-乙酸酯的助溶剂，含有解淀粉芽孢杆菌的湿菌体或干燥后的吸附有菌体的聚氨酯泡沫为催化剂，在PH5.1?8.0的缓冲体系中进行水解生成三氯蔗糖。9.如权利要求7所述的应用，其特征在于向反应体系中加入重量体积比3?5%的湿菌体或重量体积比1.0?2.0%干燥后的吸附有菌体的聚氨酯泡沫，控制反应温度30?40°C，反应时间12?24小时。10.如权利要求1所述的一种解淀粉芽孢杆菌在三氯蔗糖合成过程中催化蔗糖-6-乙酸酯合成和催化三氯蔗糖-6-乙酸酯水解的应用。
【文档编号】C12N1/20GK106047744SQ201610295481
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月6日
【发明人】孙杰, 陈梁, 娄波, 沈汉军, 金文究, 汪钊, 白彦兵
【申请人】杭州鑫富科技有限公司