一株用于防治番茄青枯病的解淀粉芽孢杆菌及其应用
【专利摘要】本发明涉及一种解淀粉芽孢杆菌W118，于2016年3月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.12200，同时要发明还提供了该解淀粉芽孢杆菌W118在防治番茄青枯病、棉花黄萎病、番茄早疫病以及黄瓜靶斑病原菌中的应用，与现有技术相比：本发明具有如下优点：田间试验表明，使用解淀粉芽孢杆菌W118生防菌制剂对番茄青枯病有一定程度的防治效果，防治效果最高达到59.2％；对其它病的防治效果：对棉花黄萎病、番茄早疫病、黄瓜靶斑病的防治效果最高分别达到47.8％、43.4％、38.3％。CGMCC No.1220020160310
【专利说明】
一株用于防治番茄青枯病的解淀粉芽孢杆菌及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于农作物防病冶病技术领域，尤其涉及一株用于防治番茄青枯病的解淀 粉芽孢杆菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 番前青枯病是由前科劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一种毁灭性的 土传细菌病害，该病可造成植株大面积萎蔫死亡，重病田的发病率达80 %以上，导致番茄产 量严重下降，严重地制约着番茄产业的发展和经济效益的提高。茄科劳尔氏菌菌系复杂，寄 主广泛，高温高湿环境下生命力顽强，能侵染50多个科450多种植物。
[0003] 目前常用的防治番茄青枯病的方法主要有:化学防治、改良土壤、选育抗病品种、 嫁接与轮作等，但效果均不稳定[34]。此外，化学药剂的使用会带来环境的污染和食品安全 等一系列问题，因此生物防治不失为一条环保、经济、有效的防治途径。已经成为防治该病 害的重点发展方向。
[0004]生物防治主要是利用拮抗微生物及其代谢产物防治植物病害。目前，已经报道的 用于防治青枯病的诘抗细菌主要包括芽孢杆菌属（B a c i 11 u s s p p )、假单胞杆菌属 (Pseudomonas spp)和链霉菌属（Streptomyces spp)等。其中芽孢杆菌属由于其生长速度 快，耐高温、耐辐射、耐高酸碱，且能产生多种拮抗类物质，是拮抗细菌研究中的重点。
[0005] Plant Growth-promoting Rhizobacteria(PGPR)指的是生活在植物根际附近的 一类有益微生物，这类微生物往往具有拮抗病原微生物、溶磷作用、固氮作用、增强植物抗 病、增强营养吸收等作用，因此，从植物根际处分离筛选得到的PGPR菌株具有重要的意义。
[0006] 解淀粉芽孢杆菌是活跃在植物根际的一类微生物，既有芽孢杆菌属所拥有的优 点，又属于PGPR-大类，解淀粉芽孢杆菌的抗病机理主要有以下几个方面:第一，菌株通过 产生活性物质或者改善矿物质营养促进植物营养生长，间接帮助植物抵御病虫害的侵染； 第二，菌株产生代谢物质或者通过竞争作用抑制或者阻碍根际病原微生物的发展，间接促 进植物的生长，其生防作用机理主要包括有效的根部定殖，抗生作用，根际营养竞争(特别 是对铁的竞争）、分泌降解微生物的酶和诱导植物抗性等。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种解淀粉芽孢杆 菌W118,是一种从番茄青枯病发病严重的健康根际土壤中分离筛选出对番茄青枯病具有拮 抗作用的生防细菌菌株，能够有效抑制番茄青枯病病原菌的繁殖生长，对番茄青枯病的防 治具有重要意义。
[0008] 本发明所要解决的另一个技术问题是针对现有技术的现状提供解淀粉芽孢杆菌 W118的应用。
[0009] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:该解淀粉芽孢杆菌W118,于2016 年3月10日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.12200。
[0010] 本发明还提供上述解淀粉芽孢杆菌W118的应用，其特征在于对防治番茄青枯病的 应用。
[0011] 以及上述解淀粉芽孢杆菌W118的应用，还体现在:对防治棉花黄萎病、对番茄早疫 病以及黄瓜靶斑病防治中的应用。
[0012] 上述解淀粉芽孢杆菌W118在制备生防菌剂中的应用，其特征在于:所述防菌剂的 有效剂量范围为1 ·〇Χ 1〇7~1 ·〇X l〇9cfu/ml·。
[0013] 上述解淀粉芽孢杆菌W118在制备生防菌剂中的应用，其特征在于:所述防菌剂的 有效剂量范围为1 ·〇 X 1〇8~1 ·〇 X l〇9cfu/ml、1 · 0 X 107~1 · 0 X 109cfu/ml、1 · 0 X 107~1 · 0 X 109cfu/ml〇
[0014] 与现有技术相比，本发明具有如下优点：田间试验表明，使用解淀粉芽孢杆菌W118 生防菌制剂对番茄青枯病有一定程度的防治效果，防治效果最高达到59.2%;对其它病的 防治效果：对棉花黄萎病、番茄早疫病、黄瓜靶斑病的防治效果最高分别达到47.8%、 43.4%、38.3%〇
[0015] 保藏说明
[0016] 1、解淀粉芽孢杆菌W1 18，分类命名为：解淀粉芽孢杆菌，Baci 1 lus amyloliquefaciens于2016年3月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No. 12200，保藏单位地址:北京朝阳区北辰西路1号院3号。
【附图说明】
[0017] 图1为本发明中解淀粉芽孢杆菌W118的菌落形态；
[0018] 图2为本发明中解淀粉芽孢杆菌W118对番茄青枯病病原菌的平板拮抗作用；
[0019] 图3为本发明中解淀粉芽孢杆菌W118对棉花黄萎病病原菌的平板拮抗作用；
[0020] 图4为本发明中解淀粉芽孢杆菌W118对番茄早疫病病原菌的平板拮抗作用；
[0021 ]图5为本发明中解淀粉芽孢杆菌W118对黄瓜靶斑病病原菌的平板拮抗作用。
【具体实施方式】
[0022]以下通过结合附图及实施例对本发明作进一步说明。
[0023 ]实施例1防治番茄青枯病的生防菌株Wl 18的获得 [0024]解淀粉芽孢杆菌的筛选与分离
[0025] (1) 土样采集自番茄青枯病发病严重大田的健康植株根际土，将健康植株连根拔 起，轻轻抖动，待大部分土抖落后，剩余紧贴根的土壤连同部分须根一起收集，用封口袋装 好，放入4°C冰箱保存备用。
[0026] (2)将10g番茄健康植株根际土加入装有90mL无菌水的三角瓶中，在30°C的摇床上 剧烈振荡30min，静置30min;
[0027] (3)取上清液系列稀释涂布于牛肉膏蛋白胨改良培养基上，每个梯度3次重复，于 30°C恒温培养24h后，用装有1.0 X 108cfu/ml的青枯菌菌液的喉头喷雾器对其喷菌；
[0028] (4)待平板出现明显的抑菌圈后，挑选有抑菌圈并形态不同的菌落进行纯化；
[0029] (5)取纯化三次初筛后的细菌，在NA平板上进行对峙复筛。30°C培养12h，用1.0 X 108cfu/ml的青枯病原菌液喷液，48h后测定抑菌圈直径，抑菌圈直径大于1.5cm的菌株，进 行保存备用。
[0030] 实施例2防治番茄青枯病的生防菌株W118的鉴定
[0031] 将菌株W118接种于牛肉膏蛋白胨改良培养基上，30°C培养48h，以细菌基因组DNA 提取试剂盒提取拮抗菌株的基因组DNA，采用细菌16SrRNA引物进行扩增。（？：5'_ AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ' R: 5 ' -TACCTTGTTACGACTT-3 '）。反应体系为：Mg2+2 · 5μ1，10 X buffer 2.5yl，dNTP(10mmol · L-42μ1，上下游引物（lOmmol · L-3各ΙμL，模板DNAlyl，Taq 酶(5U · μΓ^Ο.βμΙ,?ΜΚ?Ο 14.7μ1，总体系为25μ1。所用试剂均购自大连宝生物工程有限公 司。
[0032] PCR 反应条件:95 °C 预变性 5min，95 °C 变性 30s，53 °C 退火 lmin，72°C 延伸 2min，72°C 保持lOmin，共循环30次。PCR产物用1 % (w/v)的琼脂糖凝胶电泳进行检测，电压90V，15min， EB染色30min，找到目标条带。PCR扩增产物的纯化采用Axygen公司的凝胶纯化试剂盒，具体 操作见说明书。纯化的PCR产物于-20°C保存备用。
[0033] 选用Takara公司的T载体与扩增的16S rRNA基因片段酶连，反应体系为10yl:DNA 片段5μ1，pMD19-T载体0.3μ1，Solution I溶液5μ1，16°C过夜。将连接有目的片段的质粒转 化大肠杆菌感受态细胞中，进行蓝白斑筛选，将阳性克隆送往上海美吉生物医药科技有限 公司测序鉴定。
[0034] 根据16S rRNA基因的测序结果，在http://www.ncbi .nlm.nih.gov在线查询分析， 利用Blast软件在GenBank中与其它菌株的16S rRNA基因序列进行同源性比较，选择相近的 序列和测序菌株的序列用MEGA5.0软件构建16S rRNA基因系统进化树。结果表明，菌株 W118的16S rDNA序列与跟其他比对的100株芽孢杆菌属同源相似性都很高，而与解淀粉芽 胞杆菌(8.31^1〇1丨9脱€3(^6118〇3]\17，％014551)的同源性最高，为99%，鉴定1118为解淀粉 芽孢杆菌。
[0035] 实施例3解淀粉芽孢杆菌W118对番茄青枯病病原菌的拮抗作用
[0036]在牛肉膏蛋白胨改良培养基上用无菌牙签点接纯化后的菌株W118,30°C培养12h， 用1.0 X 108cfu/m的青枯病原菌液喷液，48h后测定抑菌圈直径，重复3次，观察抑菌圈大小， 由附图1和2可见解淀粉芽孢杆菌W118对番茄青枯病菌抑制作用较强。
[0037]实施例4解淀粉芽孢杆菌W118对其他植物病害病原菌的拮抗作用 [0038]采用平板对峙法，测试解淀粉芽孢杆菌W118对棉花黄萎病（Verticil lium dahliae Kleb.)、番前早疫病(Alternaria Nees)以及黄瓜革E斑病(Corynespora)这三种病 害的病原菌的拮抗作用，将病原菌在Η)Α平板上28°C培养7d，用直径为5mm的打孔器在平板 上打取圆形琼脂块。将直径为5mm的植物病害的病原菌菌饼接入PDA平板中央，28 °C培养2d， 然后，用灭菌牙签在病原菌菌饼周围等距离处点接种待测的拮抗细菌W118,于培养箱中28 °C培养5d后观察记录抑菌圈的有无及抑菌圈直径。每个处理重复3次。
[0039] 解淀粉芽孢杆菌W118抑菌谱较广，对棉花黄萎病、番茄早疫病、黄瓜靶斑病具有拮 抗作用，具体见表1及附图3、4和5,从附图3中可以看出解淀粉芽孢杆菌W118对棉花黄萎病 病原菌具有拮抗作用；从附图4中可以看出解淀粉芽孢杆菌W118对番茄早疫病原菌具有拮 抗作用;从附图5中可以看出解淀粉芽孢杆菌W118对黄瓜靶斑病病原菌具有拮抗作用。
[0040] 表1解淀粉芽孢杆菌W118对多种病原菌的平板拮抗作用
[0042]实施例5解淀粉芽孢杆菌W118发酵液对番茄青枯病的田间防治效果 [0043]田间试验在宁波市鄞州区横溪基地内进行，试验材料为菌株W118发酵液，试验设 置1 · 0 X 106cfu/ml、1 · 0 X 107cfu/ml、1 · 0 X 108cfu/ml、1 · 0 X 109cfu/ml 4个浓度梯度，于番 茄苗移栽1个月后开始施用拮抗菌株的发酵液，每隔7d施用1次，共计3次。每株番茄苗浇灌 10ml，每处理3次重复，以施用等量清水为对照。
[0044]病情调查:每次浇灌菌后7d调查并记录各处理番茄植株的发病情况，统计各处理 的病情指数和防治效果。根据植株叶片萎蔫程度，将发病级数分为5级:0级，植株正常；1级， 植株叶片萎蔫<25% ; 2级，26% <植株叶片萎蔫<50% ; 3级，51 % <植株叶片萎蔫<75% ; 4级，76 % <植株叶片萎蔫或死亡。
[0045] 病情指数=Σ (病级数X该病级植株株数)/(最大病级数X总株数）X 1〇〇
[0046] 防治效果（％ )=(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数X 100
[0047] 表2解淀粉芽孢杆菌W118发酵液对番茄青枯病的防治效果
[0049] 1)平均值土标准差。同列中不同小写字母表示在0.05水平差异显著，字母相同表 示无差异性，字母不同则表示有差异性。
[0050]从上表2中可以看出，W118发酵液对番茄青枯病的防治效果是随着W118发酵液浓 度的升高而提高，并且浓度于1. 〇 X l〇9cfu/ml在3次灌菌后的防治效果最好，在1.0 X 107cfu/ml、1 · 0 X 108cfu/ml、1 · 0 X 109cfu/ml这三个浓度中防治效果差异性不显著，但1 · 0 X106cfu/ml在上述4个浓度梯度中防治效果相对较差，且3次灌菌后的防治效果与其他浓 度处理差异显著，因此，建议推荐浓度为1.0 X 1〇7~1.0 X 109cfu/ml，其3次灌菌后的防治效 果为 46.7%~59.2%。
[0051 ]实施例6解淀粉芽孢杆菌W118发酵液对棉花黄萎病的田间防治效果
[0052]田间试验在宁波市慈溪市长河镇农户田上进行，试验材料为解淀粉芽孢杆菌W118 发酵液，试验设置1 · 0 X 106cfu/ml、1 · 0 X 107cfu/ml、1 · 0 X 108cfu/ml、1 · 0 X 109cfu/ml 4个 浓度梯度，于棉花苗移栽1个月后施用菌株发酵液，每隔7d施用1次，共计3次。每株棉花苗浇 灌10ml，每处理3次重复，以施用等量清水为对照。
[0053]病情调查:每次浇灌菌7d后调查并记录各处理棉花植株的发病情况，统计各处理 的病情指数和防治效果。棉花黄萎病分级标准为:〇级：棉株健康，无病叶，生长正常；1级:棉 株发病叶片变黄萎蔫<25% ; 2级：26% <棉株发病叶片变黄萎蔫<50% ; 3级：51 % <棉株 发病叶片变黄萎蔫<75%，变黄萎蔫;4级:棉株发病叶片变黄萎蔫大于等于76%。
[0054]病情指数=Σ (病级数X该病级植株株数)/(最大病级数X总株数）X 1〇〇
[0055] 防治效果（％ )=(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数X 100
[0056] 表3解淀粉芽孢杆菌W118发酵液对棉花黄萎病的防治效果
[0058] 1)平均值土标准差。同列中不同小写字母表示在0.05水平差异显著，字母相同表 示无差异性，字母不同则表示有差异性。
[0059]由表3可知，W118发酵液对棉花黄萎病的防治效果于浓度为1.0X109cfu/ml在3次 灌菌后的防治效果最好，其中，在浓度为1.0 X 108cfu/ml和1.0 X 109cfu/ml下，3次灌菌后的 防治效果最好，且与其他浓度处理差异显著。因此，建议推荐使用浓度为1.0X10 8~1.0X 109cfu/ml，3次灌菌后的防治效果为46.1 %~47.8%。
[0060]实施例7解淀粉芽孢杆菌W118发酵液对番茄早疫病的田间防治效果 [0061 ]田间试验在宁波市农科院横溪试验基地上进行，试验材料为解淀粉芽孢杆菌W118 发酵液，试验设置1 · 0 X 106cfu/ml、1 · 0 X 107cfu/ml、1 · 0 X 108cfu/ml、1 · 0 X 109cfu/ml 4个 浓度梯度，于番茄苗移栽40天后施用菌株发酵液，浓度为1.0 X 108cfu/ml，每隔7d施用1次， 共计3次。每株番茄苗浇灌10ml，每处理3次重复，以施用等量清水为对照。
[0062] 病情调查:每次浇灌菌7d后调查并记录各处理番茄植株的发病情况，统计各处理 的病情指数和防治效果。病情分级标准如下:〇级:无病斑；1级：病斑面积<25% ;2级:26% <病斑面积< 50 % ; 3级:51 % <病斑面积< 75 % ; 4级:病斑面积彡76 %。
[0063] 病情指数=Σ (病级数X该病级植株株数)/(最大病级数X总株数）X 1〇〇
[0064] 防治效果（％ )=(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数X 100。
[0065]表4解淀粉芽孢杆菌W118发酵液对番茄早疫病的防治效果
[0066]
[0067] 1)平均值土标准差。同列中不同小写字母表示在0.05水平差异显著，字母相同表 示无差异性，字母不同则表示有差异性。
[0068]从表4可以看出，W118发酵液对番茄早疫病的防治效果也是随着W118发酵液浓度 的升高而提高，并且浓度于l.〇Xl〇9cfu/ml在3次灌菌后的防治效果最好。其中，在浓度为 1.0 X 106cfu/ml，3次灌菌后的防治效果最差，且与其他浓度处理差异显著，因此，建议推荐 使用浓度为1.〇 X 1〇7~1.〇 X l〇9cfu/ml，其3次灌菌后的防治效果为35.9%~43.4%。
[0069]实施例8解淀粉芽孢杆菌W118对黄瓜靶斑病的田间防治效果 [0070]田间试验在宁波市农科院横溪试验基地上进行，试验材料为W118发酵液，试验设 置1 · 0 X 106cfu/ml、1 · 0 X 107cfu/ml、1 · 0 X 108cfu/ml、1 · 0 X 109cfu/ml 4个浓度梯度，在黄 瓜苗移栽后45天施用菌株发酵液，每隔7d施用1次，共计3次。每株黄瓜苗浇灌10ml，每处理3 次重复，以施用等量清水为对照。
[0071] 病情调查:每次浇灌菌7d后调查并记录各处理黄瓜植株的发病情况，统计各处理 的病情指数和防治效果。叶片被害分级标准:〇级:无病斑；1级:病斑面积<5% ;2级:6%< 病斑面积< 10% ; 3级：11 % <病斑面积<20% ; 7级:21 % <病斑面积<40% ;9级:病斑面积 ^41%
[0072] 病情指数=Σ (病级数X该病级植株株数)/(最大病级数X总株数）X 1〇〇
[0073] 防治效果（％ )=(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数X 100。
[0074] 表5解淀粉芽孢杆菌W118发酵液对黄瓜靶斑病的防治效果
[0075]
[0076] 1)平均值土标准差。同列中不同小写字母表示在0.05水平差异显著，字母相同表 示无差异性，字母不同则表示有差异性。
[0077] 从表5可以看出，W118发酵液对黄瓜靶斑病的防治效果也是随着W118发酵液浓度 的升高而提高，并且浓度于1 .〇X l〇9cfu/ml在3次灌菌后的防治效果最好，在1 .OX 107cfu/ ml、1.0 X 108cfu/ml、1.0 X 109cfu/ml这三个浓度中防治效果差异性不显著，但在浓度为1.0 X106cfu/ml，3次灌菌后的防治效果最差，且与其他浓度处理差异显著，因此，建议推荐使 用浓度为1. 〇 X 1〇7~1.〇 X l〇9cfu/ml，其3次灌菌后的防治效果为33.1 %~38.3%。
【主权项】
1. 一株解淀粉芽孢杆菌W118,于2016年3月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No. 12200。2. -种根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌Wl 18的应用，其特征在于对防治番茄青 枯病的应用。3. -种根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌Wl 18的应用，其特征在于对防治棉花黄 萎病、对番茄早疫病以及黄瓜靶斑病原菌的应用。4. 一种利用权利要求2所述的解淀粉芽孢杆菌W118在制备生防菌剂中的应用，其特征 在于:所述生防菌剂的有效剂量范围为1.0 XIO7~1.0 X 109cfu/ml。5. -种利用权利要求3所述的解淀粉芽孢杆菌W118在制备生防菌剂中的应用，其特征 在于:所述防菌剂对棉花黄萎病、番茄早疫病、黄瓜靶斑病的有效剂量范围分别为1 .〇 X IO8 ~1 · 0 X 109cfu/ml、1 · 0 X IO7~1 · 0 X 109cfu/ml、1 · 0 X IO7~1 · 0 X 109cfu/ml 〇
【文档编号】C12N1/20GK105950506SQ201610343396
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月20日
【发明人】王丽丽, 袁赛飞, 吴凯, 李国安, 姚红燕, 金树权, 汪峰, 孙梅梅, 周金波, 谌江华
【申请人】宁波市农业科学研究院