专利名称：一种利用枯草芽孢杆菌6-7产耐热β-淀粉酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种野生型枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis6_7生产胞外耐热^ -淀粉酶的生产菌及其优化工艺方法，属酶工程及发酵工程技术领域。
背景技术：
e -淀粉酶-amylase，EC3.2.1.2)又称麦芽糖苷酶、糖原酶、糖原淀粉酶，其系统名为a-1，4-葡聚糖-4-麦芽糖水解酶(a-1，4-D_glucan maltohydrolase)。3 _淀粉酶是一种外切型糖化酶，作用于淀粉时，能从a-1，4糖苷键的非还原性末端顺次切下一个麦芽糖单位，生成麦芽糖及大分子的￠-极限糊精，但不能水解a-l，6_糖苷键，遇到a-1，6键的分支点，则停滞不前，故水解速度较慢。当其水解支链淀粉时，直链部分生成麦芽糖，而分支点附近及内侧因不能被水解而残留下来。由于该酶作用底物时，发生沃尔登转位反应(Walden inversion),使产物由a -型变为￠-型麦芽糖,故名P _淀粉酶。^ -淀粉是淀粉加工过程中的主要糖化酶之一，反应不需要辅酶，且条件温和，副产物少，可作为饴糖、啤酒、饮料等工业生产上的糖化剂，在食品加工、啤酒发酵、纺织品、医药、化工医学分析等行业有着重要的应用价值。其中微生物来源的￠-淀粉酶由于其生产成本低、环境危害小、产酶活性高，便于工业生产；随着酶工业的不断发展以及人们对麦芽糖质量的更高要求，应用酶制剂生产麦芽糖浆已成为研究的热点，￠-淀粉酶的需求量不断增加使得其成为最具发展前途的工业酶之一。目前，市场上销售的P淀粉酶有两种:一种是微生物(包括细菌及真菌)发酵生产的；另一种是传统工艺从植物中提取的。长期以来植物来源的大麦3-淀粉酶一直被广泛用于多个领域，目前在怡糖、啤酒等工业中几乎都使用由植物中获得的￠-淀粉酶。如杰能科的大麦￠-淀粉酶(商品名OPTLMALT BBA)最受欢迎，但仍不能满足国内生产上的需求，所以寻找适合性价 比高的￠-淀粉酶以确保高麦芽糖的生产需要。且从植物中提取3 -淀粉酶，工艺粗糙，酶活力低，耗费了大量的生物质能源。自1972年发表了微生物中也存在呈现与高等植物￠-淀粉酶相同作用机制的酶以来，已经发现了许多微生物是￠-淀粉酶生产菌，其在耐热方面优于植物来源的淀粉酶。近年来，国内外报道的由微生物产￠-淀粉酶的菌株主要有蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、巨大芽抱杆菌(Bacillus megaterium)、多粘类芽抱杆菌(Bacillus polymyxa)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)等芽孢杆菌属、热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、链霉菌属(Streptomycessp.)等。现已报道的微生物￠-淀粉酶大多为中温型，最适反应温度为40°C 60°C;热硫梭菌(Clostridium thermosulfurog)合成的P _淀粉酶最适反应温度为75°C,但其为厌氧型菌株，生长温度为60°C较为苛刻，并不适合于工业化生产的要求，因此筛选产耐高温淀粉酶的芽孢杆菌属菌株则是研究重点。木薯是世界三大薯类之一，广泛栽培于热带和亚热带地区，在我国热带地区，木薯是仅次于水稻、甘薯、甘蔗和玉米的第五大作物，具有适应性强、种植地域广泛的特点。相对其他经济作物，利用木薯发酵生产成本低，可以做到不与人争粮。因此开发以木薯为原料发酵生产3-淀粉酶的新工艺具有十分诱人的商业前景。本发明所涉及的野生型枯草芽孢杆菌产胞外耐热P -淀粉酶不仅温度、pH适应范围广且耐热耐酸性能好，展示了诱人的工业应用前景和商业价值。
发明内容
针对目前P -淀粉酶主流来源为植物，但难以进行稳定的供应，且生产量有限度。另一方面，微生物来源的3 -淀粉酶，因生产率低、耐热性较差、生产成本高，很少能实现实用化。本发明提供一种生产耐热性3-淀粉酶的菌株及其低成本发酵工艺方法，包括菌株的筛选、培养基的优化、发酵条件的优化及酶学性质的研究，利用木薯为原料发酵生产3 -淀粉酶的方法。本发明提供野生型枯草芽孢杆菌利用木薯发酵生产胞外3 -淀粉酶，具有耐热性、成本低、产量高、产品性能好的优点，为工业化生产奠定基础。本发明目的之一是获得一种生产耐热性P -淀粉酶的菌株Bacillussubtilis6-7。该菌株在申请人此前的发明申请中(相关专利申请号:201010167019.7)已经公开了，并且此前已经提交了保藏证明和存活证明。对该菌株的相关研究得到如下结论:1.培养基及培养条件
LB培养基:胰蛋白胨I %、酵母提取物0.5 %、氯化钠I %，pH7.0淀粉固体培养基:胰蛋白胨I %、酵母提取物0.5%、氯化钠I %、可溶性淀粉I %及琼脂粉2%，pH7.0初筛培养基:胰蛋白胨I %、酵母提取物0.5%、氯化钠I %、可溶性淀粉I %,pH7.0复筛培养基:胰蛋白胨I %、酵母膏0.5 %、葡萄糖0.1 %、可溶性淀粉0.5 %、磷酸二氢钾0.2%、七水合硫酸镁0.05%、二水合氯化钙0.02%, pH7.0。本发明目的之二在于提供一种枯草芽孢杆菌B.subtilis6-7生产耐热P -淀粉酶的工艺方法，且使成本低廉，原料来源广泛，包括培养基的优化，发酵条件的优化，通过以下技术方案实现，步骤如下:(I)基础培养基:2%葡萄糖、2%胰蛋白胨、0.5%可溶性淀粉、I %氯化钠，pH7.0，绘制生长曲线及产酶曲线(如附图1);(2)对C源进行优化，选择木薯为主要C源，并对其最适浓度进行选择(如附图2)；(3)对基础培养基其他成分进行优化:如有机N源、无机N源、无机盐、缓冲体系等;(4)优化培养基:木薯粉2%，豆柏粉4%，0.1 %磷酸氢二铵，0.00139%硫酸亚铁，
0.6%柠檬酸钠，0.4%磷酸二氢钾，0.0005%硫酸锌，0.0123%硫酸镁，0.0111%氯化钙，pH7.0 ；(5)对发酵培养条件优化:如培养温度、初始pH、装液量、转速、接种量、培养时间；(6)摇瓶培养条件:该菌在含有50ml优化培养基的250ml摇瓶中，初始pH为7.0，接种量 4% (V/V)，160-190r/min、37°C发酵培养 60h。(7)B.subtilis6-7菌株在基础培养基中培养，摇瓶培养60h，酶活达到2200.0U/ml。经C源、有机N源、无机N源、无机盐、缓冲体系等单因素实验及正交实验优化培养基，再优化培养条件，在优化培养基中根据最优培养条件摇瓶培养60h，最高酶产量达6724.0U/ml,比优化前提高了 206.45%。本发明目的之三是获得菌株B.subtilis6-7最适酶解淀粉的酶反应条件，得到以下结果:(I)该酶温度适应范围较宽，最适作用温度为65°C，且在60 70°C下保存的温度温度性较好，而70°C以上保存长时间温度稳定性较差，但保存30min内残余酶活仍较高(如附图3)。(2)该酶最适反应pH值为6.0，在pH5_7之间均有较高酶活力(如附图4)。(3)该酶分子量在65KD左右。(4)作用:作用于多糖类和寡糖类的a -1，4糖苷键，将麦芽糖游离；(5)作用底物特异性:水解可溶性淀粉、直链淀粉、支链淀粉、糖原等，不能水解 环糊精、麦芽三糖。本发明的有益效果:本发明通过从实验室已保藏的菌株及采集的土样中筛选获得高产耐热耐酸￠-淀粉酶的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis6-7，经发酵优化后，获得以廉价且来源广泛的木薯粉为碳源和豆柏粉为氮源发酵生产3-淀粉酶的方法，大大降低了生产成本。
图1B.subtilis6-7在基础培养基中的生长及产酶曲线图2不同碳源对B.subtilis6-7产酶效果图3不同反应温度下B.subtilis6-7的P -淀粉酶活力图4不同反应pH下B.subtilis6-7的P -淀粉酶活力
具体实施例方式下面，本发明将用实施例进行进一步的说明，但是它并不限于这些实施例的任一个。实施例1:产淀粉酶菌株的筛选芽孢杆菌的分离纯化:取采集的25份土样制成土壤悬液经80°C热处理15min，37°C富集培养24h，梯度稀释涂布LB固体平板中37°C培养24h，再划线分离出单菌落，直至获得纯种，并将纯种菌株编号并斜面保藏、甘油冻管保藏。然后芽孢染色、革兰氏染色镜检，确定筛选的菌落为芽孢杆菌。同时将实验室保藏的菌种重新活化，热处理，再涂布于LB固体平板上，筛选出芽孢杆菌，斜面保藏、甘油冻管保藏并编号产淀粉酶菌株初选:将分离纯化获得的芽孢杆菌点种于淀粉固体培养基中，37°C培养24h，0.05%碘液染色菌落，观察透明圈及菌落圈的直径大小，并记录。将水解圈直径(D)/菌落直径(d)比值大的菌落接种于LB培养基中培养12h，甘油冻管保藏于-40°C。初筛:将水解圈直径与菌落直径比值大的菌落接种于LB培养基中活化,转接于初筛培养基中，于37°C、160rpm培养24h，测定发酵液酶活。复筛:将初筛酶活较高的菌株经LB培养基活化，转接于复筛培养基中，于37°C、160rpm培养24h，测定发酵液酶活。确定酶活最高的菌株命名为6_7，作为研究出发菌株。实施例2:淀粉酶活性的测定淀粉酶酶活的测定采用Bernfeld改良法，即DNS测定方法，利用P -淀粉酶与可溶性淀粉作用，释放麦芽糖残基的还原性，将3，5-二硝基水杨酸还原成3-氨基-5-硝基水杨酸，再用分光光度计测定还原糖的含量。在25ml比色管中加入lml2%可溶性淀粉溶液，Iml pH6.0柠檬酸缓冲液，于40°C水浴5min，加入稀释一定倍数的粗酶液1ml，混匀，于40°C水浴30min反应，反应结束后加入2ml3，5-二硝基水杨酸试剂，沸水中煮沸10ml，流水冷却，去离子水定容至25ml，在540nm下测定吸光值。酶活单位的定义:在70°C、pH6.0上述反应条件下，Iml液体酶30min水解淀粉产生等价于I U mo I麦芽糖的还原糖所需的酶量为IU，以U/ml表示。实施例3发酵培养基及培养条件的优化(I)生长曲线及产酶曲线的绘制:在基础培养基(2%葡萄糖、2%胰蛋白胨、0.5%可溶性淀粉、1%氯化钠，PH7.0)测定6-7菌株在基础培养基中的生长曲线，如附图1所示。该菌在37°C，160r/min (旋转式摇床)的条件下培养12小时后进入对数生长期，第40h进入生长稳定期，P -淀粉酶在60h累计达最高酶活2200.0U/mL。由此可知P -淀粉酶合成与菌体生长半耦合型。(2)C源的优化:将基础培养基中的葡萄糖换成可溶性淀粉、米粉、玉米粉、木薯粉、糖蜜、壳聚糖、麦芽糖、a-乳糖、葡萄糖、3-环糊精，种龄1211，接种量4(%，371:、1601'/min发酵培养。木薯为C源的酶活力可达5120.5U/mL,是可溶性淀粉为C源的2.55倍，是葡萄糖为C源的2.33倍，是玉米粉为C源的2.03倍，是米粉为C源的1.87倍，即说明木薯为C源发酵优势明显
(2)培养基优化:将基础培养基的N源换成其他有机N源，确定最佳N源及其最适浓度；添加不同无机盐，确定促进产酶的无机盐；添加不同无机氮，确定最适无机氮及添加浓度；添加不同缓冲体系，确定最佳缓冲体系；根据单因素实验，确定影响大的因素，设计4因素3水平表，进行正交优化，获得最佳培养基组合。(3)发酵培养条件的优化:在优化培养基中进行培养条件的优化，如培养温度、转速、初始pH、装液量、接种量等，确定最佳培养条件为:37°C、190r/min、初始pH7.0、50mL装液量于250mL三角瓶、4%接种量(4)酶活测定:该菌在含有50ml优化培养基的250ml摇瓶中进行摇瓶发酵，接种量4%，37°C、190r/min培养60h，离心取发酵上清液，测得酶活性达6724.0U/ml,比优化前2200.0U/mL 提高了 2.05 倍。实施例4:耐热P -淀粉酶酶学性质(I)温度对酶活性的影响相同反应体系，于30 80°C下分别测定该淀粉酶酶活力，结果如图2所示:该酶在55 75°C之间均表现较高的酶活性，说明该酶的温度适宜范围较宽，其最适作用温度为65。。。(2) pH对酶活性的影响相同反应体系，在3-8.0下分别测该酶酶活，结果如图3所示，该酶在PH5-7时酶活性较高，最适作用PH为6.0。
(3)淀粉酶蛋白分子量大小的测定将发酵得到的 粗酶液通过SDS-PAGE分析蛋白分子量，此酶分子量在65KD左右。
权利要求
1.一株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis6-7,已保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为:CTCC M2009200。
2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于，该菌为野生型的安全菌株，生产的胞外P -淀粉酶在反应温度为65°C酶活力最高，具有很高的耐热性。
3.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌生产的￠-淀粉酶，其特征在于，该酶的最适反应pH为6.0，在pH为4.5-7.5的条件下使用。
4.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌生产的￠-淀粉酶，具有以下特性: (1)该酶分子量在66KD左右； (2)作用:作用于多糖类和寡糖类的a-l，4糖苷键，生成游离￠-麦芽糖； (3)作用底物特异性:水解可溶性淀粉、直链淀粉、支链淀粉、糖原等，不能水解￠-环糊精、麦芽三糖； (4)水解可溶性淀粉产物，主要为麦芽糖，其次为少量的麦芽三糖、葡萄糖，没有麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖等低聚糖。
5.如权利要求1的高产耐热枯草芽孢杆菌6-7,其发酵培养方法: (1)种子培养:种子培养基为1%蛋 白胨、0.5%酵母膏、0.5%可溶性淀粉、1%氯化钠，PH7.0，将-40°C甘油冻管保藏的菌株接入种子培养基中，在37°C及160r/min摇瓶振荡培养12h，再转接至新鲜的种子培养基中培养12h作为二级种子液； (2)碳源木薯:木薯粉为主要碳源物质来源,含量为2% 4%，木薯块直接敲碎，机械打磨成粉，40目过筛，培养基配制时直接称取木薯粉放入三角瓶中，不经过酶解或酸解处理； (3)优化培养基其他成分:豆柏粉4%、0.1%磷酸氢二铵、0.00139%硫酸亚铁、0.6%柠檬酸钠、0.4%磷酸二氢钾、0.0005%硫酸锌、0.0123%硫酸镁、0.0111%氯化钙、pH7.0，用去离子水配制；(4)灭菌:121°C灭菌 25min ； (5)摇瓶发酵条件:250ml三角瓶装50ml的发酵培养基，接种量为4%(体积比)，37°C及190r/min摇床振荡培养，发酵64h，酶活达6724U/ml。
全文摘要
本发明提供一株野生型枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)6-7产耐热β-淀粉酶的方法。从采集的土样及实验室保藏菌种中筛选出编号为6-7的菌。在基础培养基中发酵64h酶活达2200.0U/mL，以木薯为碳源时酶活可达5120.5U/mL，提高了1.33倍。最优碳氮源为2％木薯粉、4％豆粕粉，最优培养条件为37℃、190r/min、装液量50ml/250ml三角瓶、初始pH7.0、接种量4％，摇瓶培养64h酶活可达6724.0U/ml，比优化前提高了2.06倍。所述β-淀粉酶最适反应温度、pH分别为65℃、6.0。本发明提供野生型枯草芽孢杆菌利用木薯发酵生产胞外β-淀粉酶，具有耐热性、成本低、产量高、产品性能好的优点，为工业化生产奠定基础。该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CTCC M2009200。
文档编号C12N9/28GK103205406SQ201310043510
公开日2013年7月17日 申请日期2013年2月4日 优先权日2013年2月4日
发明者饶志明, 邹艳玲, 徐美娟 申请人:江南大学