一种高转化率的枯草芽孢杆菌及其构建方法

一种高转化率的枯草芽孢杆菌及其构建方法
【专利摘要】本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种高转化率的枯草芽孢杆菌及其制备与应用。本发明首先通过质粒表达的方法解决了枯草芽孢杆菌A164转化效率低的问题，然后通过诱导转化的方法将含有comk表达框的线性片段整合到A164基因组上，借助cre/lox特异重组系统消除抗性，得到了不含抗性标记的、易于操作的、高转化效率和高分泌能力的枯草芽孢杆菌A164S。本发明的枯草芽孢杆菌A164S，研究结果表明，其转化效率为A164的1000倍以上；A164S能有效摄取同源DNA，高效分泌外源蛋白，在外源基因的重组表达方面有着较大的应用潜力。
【专利说明】
一种高转化率的枯草芽孢杆菌及其构建方法
技术领域
[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种高转化率的枯草芽孢杆菌及其制备与 应用。
【背景技术】
[0002] 枯草芽孢杆菌被认定为是一般安全(GRAS，Generally Recognized as Safe)的生 物，因其无致热源、高分泌、易培养，其产物可直接用于人们的日常使用等优点，成为工业多 肽类产品、药剂和酶制剂分泌表达的首选。枯草芽孢杆菌A164(ATCC 6051a)相比于模式菌 株A168,其生长特性、分泌能力等生化特征非常优异，是发酵工业生产菌构建的理想出发菌 株。但是A164由于DNA转化效率极抵，基因操作困难，使得A164工程菌改造的工作限制大，影 响了其在工业生产应用的前景。
[0003] 枯草芽孢杆菌的摄取外源DNA的能力，即感受态效率受到信号转导网络严密的调 控。感受态转录因子Comk在其中扮演着重要的作用，Comk的编码基因 comk的表达也在转录 和转录后水平上受到严格调控。comk的表达受到至少三个转录因子，包括AbrB、Rok(Ykuw) 和CodY的抑制，同时也受到DeqSu双组分调控系统及Comk本身的正向调控。因此，提高枯草 芽孢杆菌的感受态效率，可以从两个方面着手，其一是敲除comk基因的抑制因子，其二就是 过表达Comk正向调控因子。事实证明，这两种方式均切实可行，通过失活Rok的编码基因 rok，可以使枯草芽孢杆菌BD630的转化效率提高5倍;而通过将含有木糖启动子xylA的comk 基因导入枯草芽孢杆菌1A751，得到的枯草芽孢杆菌1A976对DNA的转化效率可以提高1000 倍。
[0004] 另一方面，经基因工程改造的微生物通常含有抗生素基因以用于遗传操作筛选， 但用于多肽、工业酶生产的领域对抗生素的添加及抗生素基因的存在十分敏感，因此，一般 要求生产菌株不含抗生素基因。因此，在对枯草芽孢杆菌进行分子改造时，通常会使用反向 筛选标记，利用细胞自身的同源重组系统将抗性基因敲除，但这种方式下的重组效率不高， 菌株二次筛选时的工作量比较大，也比较耗时；因此近年来多利用位点特异性重组系统，比 如cre/lox系统，通过外源重组酶的催化，大大提高重组效率，使得基因无痕敲除/敲入的操 作省时高效。
[0005] 但是即使是利用现代的遗传操作工具，虽然它们对枯草芽孢杆菌A168、1A976等模 式菌株十分有效，但是对于有生产应用前景的A164而言，依旧十分困难，因为A164的转化效 率极低，几乎不接受外源DNA的转化。同时，为了保证外源基因在枯草芽孢杆菌的遗传稳定 性，会通过同源重组整合到宿主的染色体中，利用线性DNA往往可以一次性完成这种分子改 造，但对于A164而言，这种由线性DNA介导的分子改造工作十分困难，耗时耗力。

【发明内容】

[0006] 为了克服目前野生型枯草芽孢杆菌转化效率低的问题，本发明的目的在于提供一 种高转化率的枯草芽孢杆菌及其制备与应用。
[0007] 为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
[0008] 本发明的第一方面，提供了一种枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌的基因组中含 有xylR-Pxy lA-comk表达单元，所述xylR-PxylA-comk表达单元的序列包括5 '至3 '方向依次 排列的xylR基因序列、xylA启动子基因序列、comk基因序列。
[0009] 优选地，所述枯草芽孢杆菌的基因组中整合有xylR-Pxy lA-comk表达单元，所述 xylR-PxylA-comk表达单元的序列包括5'至3'方向依次排列的xyIR基因序列、xyIA启动子 基因序列、comk基因序列。
[0010] 优选地，所述xylR-PxylA-comk表达单元的基因序列如SEQ ID NO. 12所示。
[0011]优选地，所述枯草芽孢杆菌由枯草芽孢杆菌A164改造获得。
[0012]优选地，所述枯草芽孢杆菌是将枯草芽孢杆菌A164中的中性蛋白酶基因 nprE敲除 并替换为xylR-PxylA-comk表达单元构建获得。
[0013]优选地，被敲除的中性蛋白酶基因 nprE的基因序列如SEQ ID NO. 11所示。
[0014]进一步地，所述枯草芽孢杆菌除了中性蛋白酶基因 nprE被敲除和替换之外，还可 经过其他基因改造。
[0015] 基因改造具体是指通过生物或化学或物理的手段使基因相比改造前在结构上发 生变化。这种变化主要是指碱基对组成的变化，包括但不限于一个或多个碱基对的替换、增 添、缺失引起的改变。
[0016] 本发明的第二方面，提供了前述枯草芽孢杆菌的制备方法，包括步骤:将枯草芽孢 杆菌A164中的中性蛋白酶基因 nprE敲除，并替换为xylR-PxylA-comk表达单元。
[0017]相比中性蛋白酶基因 nprE未被敲除替换的枯草芽孢杆菌，本发明的枯草芽孢杆菌 转化效率更高。
[0018] 优选地，采用基因重组介导的基因操作敲除和替换中性蛋白酶基因 nprE。
[0019] 可以采用现有的基因重组方法敲除和替换所述中性蛋白酶基因 nprE。在优选地实 施例中，采用Cre-LoxP重组酶系统介导的基因重组方法敲除和替换所述中性蛋白酶基因 nprE。还可采用其他方法实现基因敲除和替换，并不限于实施例所列举的方式。
[0020] 基于中性蛋白酶基因 nprE的敲除和替换，nprE的完整序列从染色体DNA中去除和 被替换。
[0021] 进一步的，所述枯草芽孢杆菌还经过其他基因改造。
[0022]所述的其他基因改造是指除中性蛋白酶基因 nprE的敲除和替换以外的基因改造。 所述其他基因改造可以是单个目标基因的改造或者为多个感兴趣目标基因的改造。感兴趣 目标基因并不特指，可以根据研究需要设定并改造。例如，可以是一个、两个、三个以上目标 基因的改造。由于本发明中性蛋白酶基因 nprE被敲除和替换的苦草芽孢杆菌可在体外传 代，因此理论上可以不断对其进行基因改造，对于目标基因的改造数量可以按照需要操作， 没有特别限制。
[0023]所述基因改造包括但不限于目标基因的敲入、目标基因的敲除、目标基因的替换 等。目标基因的敲入、目标基因的敲除、目标基因的替换可以采用基因打靶、同源重组等技 术来完成，包括但不限于基于Cre-LoxP重组酶系统、ZFN(锌指核酸酶）、TALEN(转录激活样 效应因子核酸酶)和CRISPR/Cas9(成簇规律间隔短回文重复技术)等的基因操作。
[0024]凡是可以实现中性蛋白酶基因 nprE被敲除和替换及其他基因突变的其他生物技 术手段均可用于构建中性蛋白酶基因 nprE被敲除和替换且经其他基因改造的枯草芽孢杆 菌。
[0025] 优选地，还包括对所述枯草芽孢杆菌进行了单个或者多个感兴趣目标基因的改 造。
[0026] 本发明的第三方面，提供了前述枯草芽孢杆菌的用途，为将所述枯草芽孢杆菌作 为表达宿主。
[0027] 进一步地，将所述枯草芽孢杆菌作为表达宿主用于外源基因的高效表达。
[0028] 进一步地，还可将所述枯草芽孢杆菌作为表达宿主用于工业多肽类产品、蛋白类 产品、药剂和酶制剂等的高效表达。
[0029] 本发明的第四方面，提供了一种表达外源基因的方法，包括如下步骤：
[0030] 1)构建含有外源基因的重组表达载体；
[0031] 2)将步骤1)获得的重组表达载体转染本发明前述枯草芽孢杆菌，并在合适表达所 述外源基因的条件下培养所述宿主。
[0032]通过常规的重组DNA技术即可构建含有外源基因的重组表达载体，例如将目的外 源基因片段插入所述表达载体的多克隆位点。所述目的外源基因片段应当至少包含所要表 达的外源基因的完整编码区。
[0033] 获得的转有重组表达载体的枯草芽孢杆菌可以用常规方法培养，表达外源基因。 根据所用的枯草芽孢杆菌的具体情况，培养中所用的培养基可选用已知的各种合适的培养 基或培养液，在适于宿主细胞生长的条件下进行培养并表达外源基因。如果需要，可利用其 物理的、化学的和其它特性或添加纯化标签通过各种分离方法分离和纯化外源基因表达所 得产品。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：用蛋白沉 淀剂处理(盐析方法）、离心、渗透破壁、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤）、吸附层析、 离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
[0034] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0035]本发明首先通过质粒表达的方法解决了枯草芽孢杆菌A164转化效率低的问题，然 后通过诱导转化的方法将含有comk表达框的线性片段整合到A164基因组上，借助cre/lox 特异重组系统消除抗性，得到了不含抗性标记的、易于操作的、高转化效率和高分泌能力的 枯草芽孢杆菌A164S。本发明的枯草芽孢杆菌A164S，研究结果表明，其转化效率为A164的 1000倍以上;A164S能有效摄取同源DNA，高效分泌外源蛋白，在外源基因的表达方面有着较 大的应用潜力。
【附图说明】
[0036] 图1:重组质粒pMK4_cre的质粒图谱。
[0037] 图2:重组质粒pGSNE-nprlR-comk的质粒图谱。
[0038] 图3:重组质粒pMK4_comk的质粒图谱。
[0039]图4:枯草芽孢杆菌164S的构建流程图。
[0040]图5:枯草芽孢杆菌164S淀粉酶基因的敲的功能鉴定。
【具体实施方式】
[0041]在进一步描述本发明【具体实施方式】之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下 述特定的具体实施方案;还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体 实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法， 通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
[0042]当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端 点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和 科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、 材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本 发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实 现本发明。
[0043] 除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领 域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及 相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等 MOLECULAR CL0NING:A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001;Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BI0L0GY?John Wiley&Sons?New York?1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYM0L0GY ,Academic Pressman Diego ； Wolf fe ? CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION,Third edition?Academic Pressman Diego?1998；METH0DS IN ENZYM0L0GY，Vol·304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999;和METHODS IN MOLECULAR BI0L0GY，Vol.ll9，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等〇
[0044] 实施例1表达质粒pMK4_cre、表达质粒pMK4_comk和重组质粒pGSNE-nprlR-comk 的构建
[0045] I .pMK4_cre的构建
[0046] pMK4-cre是在pMK4载体的基础上连接了含有一个Pspac启动子的Cre酶表达基因 cre，用于在苦草芽孢杆菌中表达Oe酶。pMK4-cre的序列如SEQ N0.1所示，具体为：
[0047] gcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgact ggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatg cttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgc caagcttggctgcaggtcgacggatccccgggaattctacacagcccagtccagactattcggcactgaaattatgg gtgaagtggtcaagacctcactaggcaccttaaaaatagcgcaccctgaagaagatttatttgaggtagcccttgcc tacctagcttccaagaaagatatcctaacagcacaagagcggaaagatgttttgttctacatccagaacaacctctg ctaaaattcctgaaaaattttgcaaaaagttgttgactttatctacaaggtgtggcataatgtgtggaattgtgagc ggataacaattaagcttaaggaggaagcaggtatgtccaatttactgaccgtacaccaaaatttgcctgcattaccg gtcgatgcaacgagtgatgaggttcgcaagaacctgatggacatgttcagggatcgccaggcgttttctgagcatac ctggaaaatgcttctgtccgtttgccggtcgtgggcggcatggtgcaagttgaataaccggaaatggtttcccgcag aacctgaagatgttcgcgattatcttctatatcttcaggcgcgcggtctggcagtaaaaactatccagcaacatttg ggccagctaaacatgctteatcgtcggtccgggctgccacgaccaagtgacagcaatgctgtttcactggttatgcg 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[0048] 其中的PSpac-cre片段以质粒pDGC为模板，以Pc re-F(SEQIDN0.5)为上游引物， 以Pcre-R(SEQIDN0.6)为下游引物PCR扩增得到。
[0049] Pcre_F(SEQ ID NO·5)，具体为：taccgaattctacacagcccagtccaga〇
[0050] Pcre_R(SEQ ID NO·6)，具体为：ctaggaattcgcatgcctaatcgccatcttccag〇
[0051] PCR反应体系如下：
[0052] 5x PS buffer (购自 TaKLaRa 公司，含 Mg 离子等） 10 pL dNTP mix(2,5 mM) 3μ【 PcF 上游引物（10: μΜ) 3.0 rL Pcre-R 下游引物(ΙΟμΜ) 3.0 LiL DNA 模板 Ι.ΟμΙ PrimeSTAR..聚合酉每（.2,5 U/μΙ) LOpL 加水至 50 μL。
[0053] 在Mastercycler普通PCR仪(Eppendorf)上运行以下程序：
[0054] (1)98°(：，2π?η;(2)98°(：，158θ(3 ;(3)55°(：，158θ(3;(4)72°(：，1π?η 30sec;(5)循环从 (2)到(4)，30次；（6)72°(：，1〇1^11;(7)4°(：，保存。
[0055] PCR产物经Axygen PCR清洁试剂盒回收纯化后，以限制性内切酶Eco RI酶切，与经 Eco RI和去磷酸化处理的线性质粒pMK4以T4DNA连接酶连接，连接液转入大肠杆菌DH5a，从 大肠杆菌中分离得到重组质粒pMK4-cre。所述重组质粒pMK4-cre的结构示意图如图1所示D
[0056] 2. pMK4_comk 的构建
[0057] pMK4-comk是在pMK4载体的基础上连接了含有启动子xylA及其抑制基因 xylR的 comk表达基因，pMK4_comk用于在枯草芽抱杆菌中表达Comk
[0058] pMK4_comk的序列如SEQ NO. 3所示，具体为：
[0059] gcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgact ggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatg cttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgc caagcttggctgcagtcgcgatgattaattaattcagaacgctcggttgccgccgggcgttttttatgcagcaatgg caagaacgtcccggggagctcctaacttataggggtaacacttaaaaaagaatcaataacgatagaaaccgctecta aagcaggtgcattttttcctaacgaagaaggcaatagttcacatttattgtctaaatgagaatggactctagaagaa acttcgtttttaatcgtatttaaaacaatgggatgagattcaattatatgatttctcaagataacagcttctatatc aaatgtattaaggatattggttaatccaattccgatataaaagccaaagttttgaagtgcatttaacatttctacat catttttatttgcgcgttccacaatctcttttcgagaaatattcttttcttctttagagagcgaagccagtaacgct ttttcagaagcatataattcccaacagcctcgatttccacagctgcatttgggtccattaaaatctatcgtcatatg acccatttccccagaaaaaccctgaacacctttatacaattcgttgttaataacaagtccagttccaattccgatat taatactgatgtaaacgatgttttcatagttttttgtcataccaaatactttttcaccgtatgctcctgcattagct 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[0060] 其中的xylR-PxylA-comk片段以质粒pMD19T-kan-comk-lacA(SEQIDN0.4)为模 板，以Comk-psF(SEQIDN0.7)为上游引物，以Comk-psR(SEQIDN0.8)为下游引物PCR扩增 得到。
[0061 ] pMD19T-kan-comk-lacA(SEQ ID Ν0.4)具体为：
[0062] gcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgact ggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatg cttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgc caagcttgcatgcctgcaggtcgacgatcaggtcgcctgacaatatgtctcctgtcattatgtccttcacactctga tcaaacgtgaccagctgtttttcttccgtgaaattcatgacaaaaatataatcattgtcctgatcctgcctcgcttg tacggagacgccttttccgtgccgaaccggaaaaactggagagagagacaggtctgtgatcagaccctcatagaaat cacgctgaaattgatcctccaaacgcgcgccgataaaatacgccttgccctgctgatactcatggcttgtgaccgct ggcgtgcgcgcataaaaatcttcttgatacaccgcttccactgaagctgtctttacatcaatcacggttgcataatc cttcatttcatatatttggctgcggtagctgacagcgtttcgatccttcggatacagggtgtccgtttcaagaggct caactccaaatatagcttgaaatcgatatctctgcagtcgcgatgattaattaattcagaacgctcggttgccgccg ggcgttttttatgcagcaatggcaagaacgtcccggggagctcctaacttataggggtaacacttaaaaaagaatca ataacgatagaaaccgctcctaaagcaggtgcattttttcctaacgaagaaggcaatagttcacatttattgtctaa 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[0063] Comk_psF(SEQ ID NO·7)具体为：cgatatctctgcagtcgcgatgattaattaattcag〇
[0064] Comk_psR(SEQ ID N0.8)具体为：cagtctgcaggatatggtgcaagtcagcacgaac。
[0065] PCR反应体系如下：
[0066] 5x PS buffer (购自 TaKaRa 公…，含 Mg 离子等） 10 pL dNTP mix(2.5 mM) 3μL Comk-psF 上游引物（10 μΜ) 3.0 tuL Comk-psR 下游引物（10 μΜ) 3.0 [!L DNA 模板 I 0 tuL PrimeSTAR 聚合晦 C2.5 U/μΙ) LO 加水至 5:0 μΙ
[0067] 在Mastercycler普通PCR仪(Eppendorf)上运行以下程序：
[0068] (1)98°(：，2π?η;(2)98°(：，158θ(3 ;(3)55°(：，158θ(3;(4)72°(：，2π?η;(5)循环从（2)到 (4)，30次；（6)72°(：，1〇1^11;(7)4°(：，保存。
[0069] PCR产物经Axygen PCR清洁试剂盒回收纯化后，以限制性内切酶Pst I酶切，与经 PstI和去磷酸化处理的线性质粒pMK4以T4DNA连接酶连接，连接液转入大肠杆菌DH5a，从大 肠杆菌中分离得到重组质粒pMK4_comk。所述重组质粒pMK4_comk的质粒图谱如图3所示D
[0070] 3 .pGSNE-nprlR-comk 的构建
[0071] pGSNE-nprlR-comk是在pGSNE-nprlR载体的基础上连接了含有启动子xylA及其抑 制基因 xylR、Kan基因表达框、Comk编码基因和两个Iox位点，pGSNE-nprlR-comk是一种整合 型重组质粒。
[0072] pGSNE-nprlR-comk的序列如SEQ NO. 2所示，具体为：
[0073] agctctcgagaagatgatagctcatcaaaaatcccgccattgccaaataaatcgtatatggcattactgcaccataa tcttttgagatttgattgggatatggcgcaagcagcaagacaagcagtccgataatcagcgtataaaataagcctag taagatcttatccgttctccaatacagcttgaaaaacactacattcaacgcaatgggaagagtgatgatgaaaaaca gaaacacgaatgcaatcggctccatcccatccgggtattccttccaatacgaaaagaaactaaaaatcatttgtacg atcggcaaactgacaacagcaaggtcgaacgtataaaacttaccctttccgccatgatcacgcggcatcagcatata gtgaaaagccgtcagcagcacatatccgtataacaaaaaatgcagcagcggcagcagttcttttccgtcctctctta agtaagcgctggtgaagtttgttgattgcacctggtgaataagttcaacagacactcccgccagcagcacaatccgc aatataacacccgccaagaacattgtgcgctgccggtttattttgggatgatgcaccaaaagatataagcccgccag aacaacaattgaccattgaatcagcagggtgctttgtctgcttaatataaaataacgttcgaaatgcaatacataat gactgaataactccaacacgaacaacaatcctttacttcttattaaggcctcattcggttagacagcggacttttca aaaagtttcaagatgaaacaaaaatatctcatcttccccttgatatgtaaaaaacataactcttgaatgaaccacca catgacacttgactcatcttgatattattcaacaaaaacaaacacaggacaatactatcaattttgtctagttatgt 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[0074]其中的kan-lox-comk片段以质粒pMD19T-kan-comk_lacA(SEQ ID NO.4)为模板， 以Ck-npr-KpnF(SEQIDN0·9)为上游引物，以Ck-npr-NheR(SEQIDN0·10)为下游引物PCR 扩增得到。
[0075] pMD19T-kan-comk-lacA(SEQ ID N0.4)具体为：
[0076] gcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgact ggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatg cttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgc caagcttgcatgcctgcaggtcgacgatcaggtcgcctgacaatatgtctcctgtcattatgtccttcacactctga tcaaacgtgaccagctgtttttcttccgtgaaattcatgacaaaaatataatcattgtcctgatcctgcctcgcttg tacggagacgccttttccgtgccgaaccggaaaaactggagagagagacaggtctgtgatcagaccctcatagaaat cacgctgaaattgatcctccaaacgcgcgccgataaaatacgccttgccctgctgatactcatggcttgtgaccgct ggcgtgcgcgcataaaaatcttcttgatacaccgcttccactgaagctgtctttacatcaatcacggttgcataatc cttcatttcatatatttggctgcggtagctgacagcgtttcgatccttcggatacagggtgtccgtttcaagaggct caactccaaatatagcttgaaatcgatatctctgcagtcgcgatgattaattaattcagaacgctcggttgccgccg ggcgttttttatgcagcaatggcaagaacgtcccggggagctcctaacttataggggtaacacttaaaaaagaatca ataacgatagaaaccgctcctaaagcaggtgcattttttcctaacgaagaaggcaatagttcacatttattgtctaa 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atgctgtacccgaaagaagagcggacgaagatgatttatgattttattttgcgtgagetcggggaacggtattagaa aaatagccgcgggcggccgcactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcgg atacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacg tctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtcttcaagaattg atcctctagcacaaaagaaaaacgaaatgatacaccaatcagtgcaaaaaaagatataatgggagataagacggttc gtgttcgtgctgacttgcaccatatcataaaaatcgaaacagcaaagaatggcggaaacgtaaaagaagttatggaa ataagacttagaagcaaacttaagagtgtgttgatagtgcagtatcttaaaattttgtataataggaattgaagtta aattagatgctaaaaatttgtaattaagaaggagtgattacatgaacaaaaatataaaatattctcttggatccaaa gtcatatgtaccgttcgtatagcatacattatacgaagttatcccgggccagtttgttgaagattagatgctataat tgttattaaaaggattgaaggatgcttaggaagacgagttattaatagctgaataagaacggtgctctccaaatatt cttatttagaaaagcaaatctaaaattatctgaaaagggaatgagaatagtgaatggaccaataataatgactagag aagaaagaatgaagattgttcatgaaattaaggaacgaatattggataaatatggggatgatgttaaggctattggt 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ctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagc attggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatc taggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccc cgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccac cgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcg cagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacata cctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagac gatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacc tacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggta tccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtc ctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaac gccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccc tgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcg agtcagtgagcgaggaagcggaaga 〇
[0077] Ck-npr-Kpn F(SEQ ID N0.9)具体为：cttttcctaatattacaatccggtaccgtcgcgatga ttaattaattcagaacg〇
[0078] Ck-npr-Nhe R(SEQ ID NO. 10)具体为：Gggatttattgtgggtgctagctctaccgttcgtat aatg〇
[0079] PCR反应体系如下： 5x PS buffer (购自 TaKaRa 公司，含 Mg 离子等） 10 pL dNTP mix(2.5 mM) 3μL Ck-npr-KpnF 丨-·.游引物（ΙΟμΜ) 3.0 μL
[0080] Ck-npr-NheR 下游引物（1()μΜ) 3.0 μΙ_. DNA 模板 1.0 liL PrimcSTAR 聚介丨姆（2.5 U/μΙ) 1.0 μL. 加水至 5? μL
[0081 ] 在Mastercycler普通PCR仪(Eppendorf)上运行以下程序：
[0082] (1)98Γ，2π?η;(2)98Γ，158θ(：;(3)55Γ，158θ(3 ;(4)72Γ，3π?η 30sec;(5)循环从 (2)到(4)，30次；（6)72°C，10min; (7)4°C，保存。
[0083] PCR产物经Axygen PCR清洁试剂盒回收纯化。以限制性内切酶Nhe I和Kpn I双酶 切质粒pGSNE-npr IR，酶切产物经Axygen PCR清洁试剂盒回收纯化。上述纯化产物经 Infusion试剂盒(购自TaKaRa)进行连接，连接液转入大肠杆菌DH5a，从大肠杆菌中分离得 到重组质粒pGSNE-npr lR-comk。所述重组质粒pGSNE-npr lR-comk的质粒图谱如图2所示。 [0084]实例2枯草芽孢杆菌164S的构建
[0085]米用质粒口]/〇(4-(3〇1111<：463呢-即1'11?-(3〇1111<:、。]\0(4-(^6改造枯草芽抱杆菌4164(厶164 基因组序列的DDBJ/EMBL/GenBank获取号为no.CPOlll 15)，最终得到一株易于操作的高转 化效率的枯草芽孢杆菌164S，流程图见图4。
[0086] 具体操作如下：
[0087]首先，把pMK4-comk转化进入枯草芽孢杆菌A164。转化采用高渗法电击转化的方 法，
[0088] a)接种枯草芽孢杆菌A164于3mL LB培养基中，过夜培养；
[0089] b)取2.6mL过夜培养菌液转接到40mL(LB+0.5M山梨醇）中，37°C，200rpm培养至 0D600 = 0.8；
[0090] c)将菌液冰水浴IOmin，然后5000g，5min，4Γ离心收集菌体；
[0091] d)用30mL预冷的电转培养基(0.5Μ山梨醇，0.5Μ甘露醇，10%葡萄糖），重新吹悬菌 体，5000g，5min，4°C离心去上清，如此漂洗3次；
[0092] e)漂洗三次后，利用未完全除去的电转培养基将菌体吹悬后分装，每EP管分装60μ L；
[0093] f)将60yL感受态细胞中加入50ng质粒pMK4-comk，冰上孵育2min，加入预冷的电转 杯（Imm)中，设置电压2kV，电击一次；
[0094] g)电击完毕取出杯子并立即加入lmLRM(LB+0.5M山梨醇+0.38甘露醇），37°C， 200rpm，复苏3hr后，涂5yg/mL的氯霉素抗性板;37°C，过夜培养筛选得到含有pMK4-comk质 粒的枯草芽孢杆菌A164C。
[0095] 然后，通过限制性内切酶Nco I酶切线性化质粒pGSNE-nprlR-comk，通过诱导转化 的方法将线性化质粒pGSNE-npr lR-comk转化进入A164C，具体方法如下：
[0096] a)把平板活化的单菌落接种到3mL LB试管中，37°C、200rpm培养10~12h;
[0097] b)b)然取300yL培养液转接到预热的3mL LB试管中，加入滤膜灭菌的的木糖溶液 至木糖终浓度为1%，37°C、200rpm培养3h;
[0098] c)分装到2mL Eppendorf管中，按比例100ngDNA/100yL培养液加入线性化的质粒 后孵育，37 °C、200rpm培养1.5h;涂lOyg/mL的卡那霉素抗性板;37 °C，过夜培养筛选得到含 有comk整合到基因组上的含有卡纳抗性片段的菌。
[0099] 然后通过在无氯霉素添加的LB培养基中传代，筛选到消除质粒pMK4-c〇mk的枯草 芽抱杆菌A164K。
[0100] 最后，采用诱导转化的方法把pMK4-cre转化进入枯草芽孢杆菌A164K，在ere酶的 作用下使两个Iox位重组，通过印章法利用lOyg/mL的卡那霉素抗性板反向筛选，得到了丢 失两个Iox位点间的kan基因。通过在无抗生素添加的LB培养基中传代，最终筛选到消除质 粒pMK4_cr e的枯草芽孢杆菌164S。
[0101 ] 亦即，本发明本质上是用comk cassette(即xylR-PxylA-comk片段，序列参考SEQ NO. 2)替换了A164的中性蛋白酶编码基因 nprE的部分序列。具体的，本发明的是枯草芽孢杆 菌164S将枯草芽孢杆菌A164中如SEQ NO. 11所示的序列敲除，并替换为如SEQ NO. 12所示的 序列。
[0102]亦即，被敲除的序列如SEQ ID NO.11所示，具体如下：
[0103] ttaggtaagaaattgtctgttgctgtcgctgcttcgtttatgagtttatcaatcagcctgccaggtgttcaggctgc tgaaggtcatcagcttaaagagaatcaaacaaatttcctctccaaaaacgcgattgcgcaatcagaactctctgcac caaatgacaaggctgtcaagcagtttttgaaaaagaacagcaacatttttaaaggtgacccttccaaaaggctgaag cttgttgaaagcacgactgatgcccttggatacaagcactttcgatatgcgcctgtcgttaacggagtgccaattaa agattcgcaagtgatcgttcacgtcgataaatccgataatgtctatgcggtcaatggtgaattacacaatcaatctg ctgcaaaaacagataacagccaaaaagtctcttctgaaaaagcgctggcactcgctttcaaagctatcggcaaatca ccagacgctgtttctaacggagcggccaaaaacagcaataaagccgaattaaaagcgatagaaacaaaagacggcag ctatcgtcttgcttacgacgtgacgattcgctatgtcgagcctgaacctgcaaactgggaagtcttagttgacgccg aaacaggcagcattttaaaacagcaaaataaagtagaacatgccgccgccactggaagcggaacaacgctaaagggc gcaactgttcctttgaacatctcttatgaaggcggaaaatatgttctaagagatctttcaaaaccaacaggcaccca aatcatcacatatgatttgcaaaacagacaaagccgccttccgggcacgcttgtctcaagcacaacgaaaacattta catcttcatcacagcgggcagccgttgacgcacactataacctcggtaaagtgtacgattatttttattcaaacttt aaacgaaacagctatgataacaaaggcagtaaaatcgtttcttccgttcactacggcactcaatacaataacgctgc atggacaggagaccagatgatttacggtgatggcgacggttcattcttctctccgctttccggctcattagatgtga cagcgcatgaaatgacacatggcgtcacccaagaaacagccaacttgatttatgaaaatcagccaggtgcattaaac gagtctttctctgacgtattcgggtattttaacgatacagaagactgggacatcggtgaagacattacggtcagcca gcctgctcttcgcagcctgtccaaccctacaaaatacaaccagcctgacaattacgccaattaccgaaaccttccaa acacagatgaaggcgattatggcggtgtacacacaaacagcggaattccaaacaaagccgcttacaacaccatcaca aaacttggtgtatctaaatcacagcaaatctattaccgtgcgttaacaacgtacctcacgccttcttccacgttcaa agatgccaaggcagctctcattcagtctgcccgtgacctctacggctcaactgatgccgctaaagttgaagcagcct ggaatgctgtt。
[0104] 替换为的新序列如SEQ ID NO.12所示，具体如下：
[0105] gctagctcatggcaagcatatcgtatgtaatatgcttgccatcatatgactttggatccaagagaatattttatatt tttgttcatgtaatcactccttcttaattacaaatttttagcatctaatttaacttcaattcctattatacaaaatt ttaagatactgcactatcaacacactcttaagtttgcttctaagtcttatttccataacttcttttacgtttccgcc attctttgctgtttcgatttttatgatatggtgcaagtcagcacgaacacgaaccgtcttatctcccattatatctt tttttgcactgattggtgtatcatttcgtttttcttttgtgctagaggatcaattcttgaagacgaaagggcctcgt gatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatg tgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataa atgcttcaataatattgaaaaaggaagagtgcggccgcccgcggctatttttctaataccgttccccgagctcacgc aaaataaaatcataaatcatcttcgtccgctcttctttcgggtacagcataaattcctgtcttttcggcacgcggtg gtcgattctgtcttggaatttggttctgagccacgctgttcggtatacctggttctcgaacgaattataagagatcg gcagctccatcgttttcccattggaaaacgtcacttccgtatcgtcgaattcagtcgctttgaattcttttacatgc acatgggaaatccagccgcattggggtcttgtcgaagaaagtgtagggaataaaaagatttggttcgaagggtccac catgatcggcggcttgtgtgaaatttttgtcacttcataagttcctgcttttcttcccgcatagcttgatccaaaaa atcggcagcttctgtcgacaatttgcagcggcttcatgtttacataaaacacgcaatctttttcaataattttggaa cagattttgccgtctatttcttctggcagcacggcaattgttgcgccgttcacttcatacgattctaaaggtgcgtc tgttttctgactcatattatggcctcctttggatcccatttccccctttgatttttagatatcactagtttggacca tttgtcatttccccctttgatttaagtgaacaagtttatccatcaactatcttaattgagttagtttgtttatccaa taaactaactttatctcatcatatacaaaataaatgtttatttcaatgttttttttagaaaatttagttataatatt agatatgatacttttaaatatctaattcaagcttcaaaaaacaccaacttagttcggtggataaacaaaggagtggt tattattcaaattgcagatcaagctttagtaaaaaaaatgaatcaaaaattaatattagatgaaattttgaagaact cccctgtctccagggcaactctctctgagattacaggattaaacaagtctactgtctcctctcaagtaaatacactg cttgaaaaagattttatttttgaaattggggcagggcaatctagaggcggcagaagacctgtaatgcttgtttttaa taagaatgcaggctactcgattggtattgatataggagtcgactatcttaacggaattctaaccgacttagaaggaa atattattctcgagaagacttctgacttgtctagttcttccgctagtgaagtaaaagagattttatttgcacttatt catggttttgtaacccatatgcctgagtccccttatggtctagtcggaataggaatttgtgttccaggccttgtaga tcgtcatcagcaaattattttcatgcctaacttaaattggaatatcaaagatttgcagtttttaattgagagtgagt ttaatgttccggtttttgttgaaaatgaagctaatgcaggagcatacggtgaaaaagtatttggtatgacaaaaaac tatgaaaacatcgtttacatcagtattaatatcggaattggaactggacttgttattaacaacgaattgtataaagg tgttcagggtttttctggggaaatgggtcatatgacgatagattttaatggacccaaatgcagctgtggaaatcgag gctgttgggaattatatgcttctgaaaaagcgttactggcttcgctctctaaagaagaaaagaatatttctcgaaaa gagattgtggaacgcgcaaataaaaatgatgtagaaatgttaaatgcacttcaaaactttggcttttatatcggaat tggattaaccaatatccttaatacatttgatatagaagctgttatcttgagaaatcatataattgaatctcatccca ttgttttaaatacgattaaaaacgaagtttcttctagagtccattctcatttagacaataaatgtgaactattgcct tcttcgttaggaaaaaatgcacctgctttaggagcggtttctatcgttattgattcttttttaagtgttacccctat aagttaggagctccccgggacgttcttgccattgctgcataaaaaacgcccggcggcaaccgagcgttctgaattaa ttaatcatcgcgacggtacc〇
[0106] 利用普通的质粒DNA(例如pMK4、pHT01等可在苦草芽孢杆菌中自助复制的穿梭质 粒)对枯草芽孢杆菌164S进行转化，转化效率可以达到IO 4~IO5CFUAxg DNA。
[0107] 实例3枯草芽孢杆菌164S淀粉酶基因的敲除
[0108] 采用诱导转化的方式，可以方便地对枯草芽孢杆菌164S进行基因操作。利用限制 性内切酶Kpn I切割淀粉酶敲除质粒pDG364后，不做产物的清洁，直接转化枯草芽孢杆菌 164S：
[0109] a)把平板活化的枯草芽孢杆菌164S落接种到3mL LB试管中，37°C、200rpm培养10 ~12h;
[0110] b)然取300yL培养液转接到预热的3mL LB试管中，加入滤膜灭菌的的木糖溶液至 木糖终浓度为1%，37°C、200rpm培养3h;
[0111] c)分装到2mL Eppendorf管中，按比例IOOng DNA/100yL培养液加入线性化的质粒 后孵育，37 °C、200rpm培养1.5h。涂5yg/mL的氯霉素抗性板。37 °C，过夜培养。
[0112]挑取单克隆转接筛选得到的菌于含2%。(质量分数)可溶性淀粉的LB平板上，37°C 过夜培养，然后用碘液检测淀粉水解圈的方式鉴定淀粉酶敲除情况，检测结果见图5,淀粉 酶基因敲除效率大于90%。由此可见，本发明所得到的新的苦草芽孢具有很强的操作性，具 有广泛的应用前景。
[0113]以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制， 应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出 若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员， 在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更 动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对 上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围 内。
【主权项】
1. 一种枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌基因组中含有xylR-PxylA-comk表达单元，所 述xylR-PxylA-comk表达单元的序列包括5'至3'方向依次排列的xylR基因序列、xylA启动 子基因序列、comk基因序列。2. 根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述xylR-PxylA-comk表达单元 的基因序列如SEQ ID NO. 12所示。3. 根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌由枯草芽孢杆 菌A164改造获得。4. 根据权利要求3所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌是将枯草芽孢 杆菌A164中的中性蛋白酶基因 nprE敲除并替换为xylR-PxylA-comk表达单元构建获得。5. 根据权利要求4所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于，被敲除的中性蛋白酶基因 nprE的 基因序列如SEQ ID NO. 11所示。6. 根据权利要求4所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌除了中性蛋白 酶基因 nprE被敲除和替换之外，还可经过其他基因改造。7. -种制备如权利要求1~6任一权利要求所述枯草芽孢杆菌的方法，包括步骤:将枯 草芽孢杆菌A164中的中性蛋白酶基因 nprE敲除并替换为xylR-PxylA-comk表达单元。8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，采用基因重组介导的基因操作敲除和替换 中性蛋白酶基因 nprE。9. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，采用Cre-LoxP重组酶系统介导的基因重组 方法敲除和替换所述中性蛋白酶基因 nprE。10. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，还包括对所述枯草芽孢杆菌进行了单个 或者多个感兴趣目标基因的改造。11. 如权利要求1~6任一权利要求所述枯草芽孢杆菌的用途，为将所述枯草芽孢杆菌 作为表达宿主。12. 根据权利要求11所述的用途，其特征在于，将所述枯草芽孢杆菌作为表达宿主用于 外源基因的高效表达。13. 根据权利要求11所述的用途，其特征在于，将所述枯草芽孢杆菌作为表达宿主用于 工业多肽类产品、蛋白类产品、药剂和酶制剂的高效表达。14. 一种表达外源基因的方法，包括如下步骤： 1) 构建含有外源基因的重组表达载体； 2) 将步骤1)获得的重组表达载体转染如权利要求1~6任一权利要求所述枯草芽孢杆 菌，并在合适表达所述外源基因的条件下培养所述宿主。
【文档编号】C12N15/75GK105861405SQ201610297900
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月6日
【发明人】孙俊松, 纪明华, 史吉平, 姜标
【申请人】中国科学院上海高等研究院