一种用于畜禽饮水的地衣芽孢杆菌制剂的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于添加剂制剂领域，涉及地衣芽孢杆菌益生菌的制剂工艺一一将液体发 酵的地衣芽孢杆菌制成用于畜禽饮水的液体或固体制剂。
【背景技术】
[0002] 地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis)被认为是对畜禽养殖高度有效的商业 产品之一，也是我国农业部批准使用的主要益生菌品种之一。
[0003] 地衣芽孢杆菌能产生多种酶类，具有较强的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性，同时还 可降解植物性饲料中复杂碳水化合物的酶，如果胶酶、葡聚糖酶、纤维素酶等，其中很多酶 是哺乳动物和禽类在体内不能合成的酶，从而促进动物对营养物质的消化吸收。
[0004] 地衣芽孢杆菌产生的孢子是家禽饲料中可直接饲喂微生物中强有力的新型种类 之一。它可蒸汽制粒，可在肠道中生长，消耗氧气，造成更有利原籍乳酸菌和双歧杆菌的厌 氧环境，有利于这些原籍且能在肠黏膜生成菌落的有益细菌大量繁殖，产生有机酸，抑制病 原菌，从而保护畜禽肠道健康和改善禽畜生产性能。
[0005] 饲用地衣芽孢杆菌产品是以芽孢形式存在，对动物能发挥有益的作用，能在动物 消化道前部萌发成具有代谢活性的营养细胞，且具有能稳定动物肠道微生物区系的能力， 消化道中地衣芽孢杆菌数量不断增加能拮抗动物病原菌，维护和调节肠道生态平衡。
[0006] 饲用地衣芽孢杆菌能产生多种营养物质如维生素、氨基酸、促生长因子等，参与机 体的新陈代谢，且能产生乳酸，可提高动物对钙、磷、铁的利用，促进维生素D的吸收。
[0007] 地衣芽孢杆菌的液体发酵工艺成熟，作为饲料添加剂已经受到广泛的应用并起到 良好的效果。然而，在养殖现场，常需在畜禽饮水系统中添加地衣芽孢杆菌，以提高畜禽养 殖效果。但是，由于常规地衣芽孢杆菌制剂辅料、发酵杂质等过多，在畜禽饮水系统中添加， 会因为其中的杂质沉积而堵塞饮水乳头，严重时造成管道堵塞，因而不适宜于饮水添加。
【发明内容】
[0008] 本发明要解决的技术问题是提供一种地衣芽孢杆菌制剂的生产工艺，克服常规发 酵过程中出现的底物过多、杂质过多、无法进行畜禽饮水添加的问题，以达到养殖现场方便 使用的目的。
[0009] 本发明的一种用于畜禽饮水的地衣芽孢杆菌制剂的制备方法，包括液体制剂和固 体制剂的制备方法，其中，
[0010] 液体制剂的制备方法包括如下步骤：
[0011] la)取适量地衣芽孢杆菌接种于内含培养基I的三角瓶中，于培养摇床内培养，得 到一级种子；
[0012] 2a)取第一提取罐，并投入配制的培养基II，调节pH为7. 0后进行蒸煮，将蒸煮过 的液体静置沉淀，将上层清液转移至发酵种子罐；
[0013] 3a)将步骤2a)的发酵种子罐内上层清液进行高温灭菌后，投入步骤la)的一级种 子，扩大培养得到地衣芽孢杆菌菌液；
[0014] 4a)取第二提取罐，并投入配制的培养基II，调节pH为7. 0后进行蒸煮，将蒸煮过 的液体静置沉淀，将上层清液转移至发酵罐；
[0015] 5a)将步骤4a)的发酵罐内上清液进行高温灭菌后，投入步骤3a)的地衣芽孢杆 菌菌液，发酵培养直至芽孢转化率达95 %以上后，停止发酵，鉴定地衣芽孢杆菌活菌数，并 调整pH为3. 5-4. 0,得到发酵液；
[0016] 6a)根据检测含量和目标产物含量，确定稀释比例，向步骤5a)的发酵液内加注无 菌水，经100目筛网过滤后生产成地衣芽孢杆菌水平为I. OX 101(lcfu/g的液体制剂；
[0017] 固体制剂的制备方法包括如下步骤：
[0018] Ib)取适量地衣芽孢杆菌接种于内含培养基I的三角瓶中，于培养摇床内培养，得 到一级种子；
[0019] 2b)取第一提取罐，并投入配制的培养基II，调节pH为7. 0后进行蒸煮，将蒸煮过 的液体静置沉淀，将上层清液转移至发酵种子罐；
[0020] 3b)将步骤2b)的发酵种子罐内上层清液进行高温灭菌后，投入步骤Ib)的一级种 子，扩大培养得到地衣芽孢杆菌菌液；
[0021] 4b)取第二提取罐，并投入配制的培养基II，调节pH为7. 0后进行蒸煮，将蒸煮过 的液体静置沉淀，将上层清液转移至发酵罐；
[0022] 5b)将步骤4b)的发酵罐内上清液进行高温灭菌后，投入步骤3b)的地衣芽孢杆菌 菌液，发酵培养直至芽孢转化率达95%以上后，停止发酵，鉴定地衣芽孢杆菌活菌数，并调 整pH为3. 5-4. 0,得到发酵液；
[0023] 6b)将步骤5b)的发酵液用100目筛网过滤后得到清液，根据检测量和固液 比，投入可溶性辅料混合后离心并浓缩，然后经过喷雾干燥得到地衣芽孢杆菌水平为 2. OX 10ncfu/g的固体可溶性制剂。
[0024] 进一步的，所述步骤la)和步骤Ib)的地衣芽孢杆菌为保藏号为CGMCC No. 9385 的地衣芽孢杆菌，该地衣芽孢杆菌菌液含量为I. 5X 101(lcfu/g。
[0025] 进一步的，所述步骤la)和步骤lb)的培养基I为牛肉膏蛋白胨摇瓶培养基，为高 温灭菌的pH为7. 0且内含5g/L牛肉膏，10g/L蛋白胨和5g/L氯化钠的水基培养基；所述 培养摇床内培养时间为16_20h。
[0026] 进一步的，所述步骤2a)和步骤2b)的培养基II为发酵培养基，为高温灭菌的pH 为7. 0且内含5g/L膨化豆柏、12g/L玉米粉、10g/L玉米淀粉、5g/L氯化钙、10g/L酵母浸 膏、lg/L磷酸二氢钾、0. 05g/L硫酸猛、I. 8g/L硫酸镁、10g/L玉米衆、20g/L麸皮和lg/L豆 油的水基培养基。
[0027] 进一步的，所述步骤2a)、步骤4a)、步骤2b)和步骤4b)的蒸煮条件为温度100°C， 时间l_3h，沉淀时间为3-5h。
[0028] 进一步的，所述步骤3a)和步骤3b)中投入一级种子时，发酵种子罐温度为37°C， 罐压为0. 01-0. 02Mpa ;所述扩大培养条件为温度37-39 °C，时间18-20h，搅拌，通气量 10-12m3/h〇
[0029] 进一步的，所述步骤5a)和步骤5b)中投入的地衣芽孢杆菌菌液为150L;投入 地衣芽孢杆菌菌液时，发酵罐温度为37°C，罐压为0. 01-0. 02Mpa ;所述培养条件为温度 37-39°C，时间 16-24h，搅拌，通气量 800-1000m3/h。
[0030] 进一步的，所述步骤la)和步骤lb)的三角瓶含量为5L，内装2L培养基I ;所述步 骤2a)和步骤2b)的第一提取罐容量为500L，内装300L培养基II ;所述步骤4a)和步骤 4b)的第二提取罐容量为20T，内装15T培养基II。
[0031] 进一步的，所述步骤6b)可溶性辅料为糊精；所述离心采用的容器为碟式离心机； 所述浓缩条件为浓缩至原体积的30-35% ;所述喷雾干燥为于喷雾干燥塔内以进风口温度 200-220°C，出风口温度90-100°C进行喷雾干燥。
[0032] 进一步的，所述高温灭菌条件为温度121-128°C，时间30-35min。 本发明所用地衣芽孢杆菌菌液保藏号为：CGMCC No. 9385,单位为：中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，时间为：2014 年6月25日，名称为：地衣芽抱杆菌Bacillus licheniformis。
[0033] 本发明的一种用于畜禽饮水的地衣芽孢杆菌制剂的制备方法制备的地衣芽孢杆 菌液体制剂和固体制剂具有较常规发酵生产的地衣芽孢杆菌粉剂更好的水溶性及流动性； 且均可促进断奶仔猪肠道中有益微生物（乳酸杆菌和双歧杆菌）的生长和抑制有害微生物 (大肠杆菌）的繁殖，提高断奶仔猪的生长性能，并控制腹泻率。
【具体实施方式】
[0034] 为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结 合具体实施例，进一步阐述本发明。
[0035] 本实施例的一种用于畜禽饮水的地衣芽孢杆菌制剂的制备方法，包括液体制剂和 固体制剂的制备方法，其中，
[0036]液体制剂的制备方法包括如下步骤：
[0037] la)取3g浓度为I. 5 X 101Qcfu/g的地衣芽孢杆菌菌液（保藏号为CGMCC No. 9385) 接种于内含2L培养基I的5L三角瓶中，该培养基I为牛肉膏蛋白胨摇瓶培养基，为内含 5g/L牛肉膏，10g/L蛋白胨和5g/L氯化钠的水基培养基，之后调节pH为7. 0并于121°C下 高温灭菌30min，再放于培养摇床内培养18h，得到一级种子；
[0038] 2a)取容量为500L第一提取罐，并投入配制的300L培养基II，该培养基II为发 酵培养基，为内含5g/L膨化豆柏、12g/L玉米粉、10g/L玉米淀粉、5g/L氯化UlOg/L酵母 浸膏、lg/L磷酸二氢钾、0. 05g/L硫酸猛、I. 8g/L硫酸镁、10g/L玉米衆、20g/L麸皮和lg/L 豆油的水基培养基，之后调节pH为7. 0,升温至100°C进行蒸煮2h，将蒸煮后的液体静置沉 淀4h后，将上层清液转移至发酵种子罐；
[0039] 3a)将步骤2a)的发酵种子罐内上层清液进行高温灭菌（121°C )30min后，降温至 37°C，控制罐压为0. OIMpa，投入步骤la)得到的一级种子，于37°C下搅拌液体并保持通气 量为IOm3A条件下扩大培养18h得到地衣芽孢杆菌菌液；
[0040] 4a)取容量为20T第二提取罐，并投入配制的15T培养基II，培养基II的配制方 法同步骤2a)，之后调节pH为7. 0,升温至KKTC进行蒸煮2h，将蒸煮后的液体静置沉淀4h 后，将上层清液转移至发酵罐；
[0041] 5a)将步骤4a)的发酵罐内上清液进行121°C下高温灭菌30min后，降温至37°C， 控制罐压为0. OIMpa，投入150L步骤3a)的地衣芽孢杆菌