一株高产地衣素的地衣芽孢杆菌工程菌及其构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于涉及一株产地衣素（lichenysin)的地衣芽胞杆菌工程菌及其构建方 法，属于生物工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 生物表面活性素具有较高的表面活力，与化学类表面活性剂相比，其无毒、可降解 等环境友好特性，使其在环境保护、医药、化妆品和微生物采油等方面有很大的应用潜力。 由枯草芽孢杆菌所产生的脂肽Surfactin(表面活性素），是迄今为止研究得最多的表面活 性素之一。由于surfactin较高的表面活性，它被公认为是目前已知的效果最好的生物表 面活性剂之一。地衣素是由地衣芽孢杆菌所产生的脂肽类物质，其典型肽链顺序为L-Glnl -D-Leu2 -L-Leu3 -L-Val4 -L-Asp5 -D-Leu6 -L-Ile7,肽链与含有 12-17 个碳的不饱和 脂肪酸链以β羟基连成环状。它与surfactin在结构及生物合成方面都具有极高的相似 性。地衣素与Surfactin相比具有更强的表面活性和溶血活性，其对钙离子的螯合作用也 较强。但由于表面活性素家族发酵产量低、生产成本高，限制了它的应用推广和研究发展。
[0003] 在提高地衣素产量的研究中，多数学者将注意力放在地衣芽孢杆菌的培养基优化 方面。1996年Yakimov等人通过向B.licheniformisBAS50发酵培养基中添加L-glutamic acid和L-asparagine，使地衣素A产量分别提高了 2倍和4倍。2007年Joshi等人利用响 应面法优化培养基组分，使B.licheniformisK51的临界胶束稀释倍数提高了 10倍。而后 他们利用相同的方法使B.licheniformisR2在优化培养基中的地衣素产量提高了 4倍，获 得浓度达到1.lg/L的地衣素粗提物。此外，Lin等人利用N-甲基-Ν'-硝基-N-亚硝基 胍对B.licheniformisJF-2进行随机诱变，发现突变株B.licheniformisKGL11的地衣素 产量达到391mg/L，比原始菌株提高了 12倍。然而即使优化培养基，使用廉价的生产原料以 及优化发酵后处理工艺，整个发酵工艺是否经济效益化仍然取决于使用的生产菌株是否高 产，因此，选育高产、稳定的出发菌株是亟需解决的问题，而这正是本发明的研究重点。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一种高产地衣素的地衣芽胞杆菌工程菌，所述 重组菌是由克隆枯草芽胞杆菌168中surfactin合成酶的启动子Psrf，通过同源重组技术 替换菌株地衣芽胞杆菌WX-02的地衣素生物合成基因簇的启动子P1A构建而成的重组地衣 芽胞杆菌。
[0005] 所述启动子Psrf基因片段来源于GenBankAL009126.3(序列如SEQ ID N0 :1)，于 同源重组的同源臂上臂Psrf-up基因片段来源于GenBankΗΙΗΠΟΟΟΟΟΙ.1(序列如SEQ ID NO :2)，同源臂下臂Psrf-down基因片段来源于GenBank AHIF01000001. 1(如SEQ ID NO : 3) 〇
[0006] 将启动子Psri；片段和同源臂Psrf-up、Psrf_downp利用S0E-PCR反应连接在一起， 得到拼接片段Psrflch。用限制性内切酶BamHI和XbaI对Psrflch片段和T2(2)-〇ri 进行酶切，并通过连接反应将Psrflch片段插入质粒T2 (2) -ori的BamH I和Xba I位点之 间，将连接产物转化E. coliDH5a。转化子经PCR验证确定为阳性克隆后，测序验证，得到重 组质粒T2 (2) -Psff。再将测序验证正确的载体T2 (2) -Psrf电转化地衣芽胞杆菌WX-02中 得到重组菌B. licheniformis WX02_Psrflch。
[0007] 所述重组菌生长地衣素的工艺为：
[0008] (1)种子培养：
[0009] 种子培养基：6-10g/L蛋白胨；2-8g/L酵母浸出粉；15g/L氯化钠；ρΗ7· 0-7. 2;固 体培养基加琼脂15g/L;
[0010] 种子培养：250mL三角瓶，装液量50mL，培养温度37°C，摇床转速180r/min，培养到 0D600 为 1. 0 ;
[0011] (2)发酵培养：
[0012] Copper's基础培养基：葡萄糖2g/L;硝酸铵4g/L;磷酸氢二钠40mmol/L;磷 酸二氢钾 30mmol/L;硫酸镁 0. 8mmol/L;硫酸亚铁 300μmol/L;硫酸猛 200μmol/L; 氯化钙7. 0μΜ;乙二胺四乙酸二钠盐4. 0μΜ;pH7. 0 ;地衣素优化发酵培养基：葡萄糖 10-50g/L;硝酸铵 2-6g/L;磷酸氢二钠 20-160mmol/L;磷酸二氢钾 15-120mmol/L;硫酸镁 0· 4-1. 2mmol/L;硫酸亚铁 75-1200μmol/L;硫酸锰 100-800μmol/L;氯化钙 7. 0μmol/L; 乙二胺四乙酸二钠盐4.0μmol/L;ρΗ7·0。
[0013]发酵培养条件：250mL三角瓶，装液量30mL，发酵温度37°C，摇床转速240r/min，发 酵时间48h。
[0014] 本发明的优势在于：本发明首次实现了地衣素合成由枯草芽孢杆菌的启动子Psrf 控制下在地衣芽孢杆菌中合成表达，且证明了启动子Psrf是可在地衣芽孢杆菌中应用的高 效的外源启动子。
【附图说明】
[0015]图 1 重组质粒T2(2)_Psff中同源臂Psrf-up、Psrf_down、插入片段Psrf及S0E-PCR 融合片段的PCR扩增产物。泳道M:DL5000DNA分子量Maker;泳道1 :同源臂上臂Psrf-up PCR扩增产物（引物PF/Psrf-upR;片段长度842bp);泳道2 :同源臂下臂Psrf-downPCR 扩增产物（引物Psrf-downF/PR;片段长度932bp);泳道3 :启动子PsrfPCR扩增产物（引 物Psrf-F/Psff-R;片段长度626bp);泳道4 :S0E-PCR扩增产物（引物PF/PR;片段长度 2306bp)。
[0016] 图2重组菌的PCR验证。分别以重组菌B. licheniformis WX02_Psrflch总DNA 和亲本菌株WX-02总DNA为模板，利用不同的引物扩增进行PCR验证，WX-02作为对照。泳 道M :DL5000DNA分子量Maker ;泳道1、2 :以Ver-L和Psrf-VR作为引物扩增（以重组菌总 DNA为模板扩增片段长度1599bp，WX-02中无特异性条带）；泳道3、4 :以Psrf-VL和Ver-R 作为引物扩增（以重组菌总DNA为模板扩增片段长度1691bp，WX-02中无特异性条带）；泳 道5、6 :以Ver-L和Ver-R作为引物扩增（以重组菌总DNA为模板扩增片段长度3169bp，以 WX-02总DNA为模板扩增片段长度3305bp)。
【具体实施方式】
[0017] 实施例1.重组质粒T2 (2) -Psrf的构建
[0018] 用于扩增枯草芽胞杆菌168中surfactin合成酶的启动子Psrf的引物：
[0019] Psrf-F: 5 ' -CCATGTAGCAGGCGAAACTCAGCCTGCGACGCTCTTCGCAAGGGTGTC-3 '
[0020] Psrf-R:5'-GTCAGCGGGTAAAATGTGTTTCCCATATTGTCATACCTCCCCTAATC-3 '
[0021] 以枯草芽孢杆菌168基因组DNA为模板PCR得到Psrf基因片段。
[0022] 用于扩增地衣芽胞杆菌WX-02中地衣素启动子P1A上游片段（同源臂上臂） Psff-up的引物：
[0023] PF: 5 ' -CGCGGATCCACGTATGCGCAGGGGAAAATGGATTG-3 '（下划线序列表示限制性内 切酶识别位点BamHI)
[0024] Psrf-upR: 5' -GACACCCTTGCGAAGAGCGTCGCAGGCTGAGTTTCGCCTGCTACATGG-3 '
[0025] 以地衣芽孢杆菌WX-02基因组DNA为模板PCR得到Psrf-up基因片段。
[0026] 用于扩增地衣芽胞杆菌WX-02中地衣素启动子P1A下游片段（同源臂下臂） Psrf-down的引物：
[0027] Psrf-downF: 5' -GATTAGGGGAGGTATGACAATATGGGAAACACATTTTACCCGCTGAC-3 '
[0028] PR:5' -GCTCTAGATTCAATGGAGGCTTTCATCGGAATCGTC-3'（下划线序列表示限制性内 切酶识别位点XbaI)
[0029] 以地衣芽孢杆菌WX-02基因组DNA为模板PCR得到Psrf-down基因片段。
[0030] Psrflch片段是利用Psrf基因片段、Psrf-up片段和Psrf-down片段为模板，引物 PF和PR作为引物进行S0E-PCR扩增得到的。用限制性内切酶BamHI和XbaI对Psrflch 片段和T2 (2) -ori进行酶切，并通过连接反应将Psrflch片段插入质粒T2 (2) -ori的BamHI 和XbaI位点之间，得到重组质粒T2 (2) -Psrf。
[0031] 实施例2.地衣素合成酶启动子的置换
[0032] 将测序验证正确的载体T2 (2) -Psrf电转化地衣芽胞杆菌WX-02。接种地衣芽胞杆 菌WX-02于5mLLB培养基，37°C，180r/min过夜培养；过夜培养物2. 5mL转接至50mL地衣 芽胞杆菌的电转化生长培养基中，250r/min，37°C2h(0D600为0. 8~0. 9)，将摇瓶置冰浴 10mia;5500r/min离心6min后收集菌体，用地衣芽胞杆菌的电转化洗涤培养基洗涤菌体3 次（30mL洗涤液/次），最后重悬于lmL洗涤培养基中，并迅速分装于1. 5mL离心管中，每管 100μL，-80°C保存，即为感受态细胞。取一管感受态细胞加入5μL质粒DNA(50ng/μL)，将 细胞转至预冷的电转化杯（〇. 2cm)中，冰浴1~1. 5min，用电脉冲转化仪2. 5kV电击1次， 电击完后迅速加900μL地衣芽胞杆菌的电转化恢复培养基，37 °C下恒温水浴lh，再在摇床 上100r/min恢复培养2h，涂含有20μg/mL的卡那霉素抗性平板，37°C培养20h，筛选转化 子。
[0033] 挑取阳性克隆单菌落在含抗生素的LB培养基中培养8h，然后在含抗生素的LB平 板上划线，45°C培养