一株犬源地衣芽孢杆菌Y₁₀及其应用的制作方法

专利名称：一株犬源地衣芽孢杆菌Y₁₀及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株经分离而获得的耐酸、耐胆盐、抑菌效果好且能较显著改善犬肠道环境，促进微生态平衡从而降低腹泻率的地衣芽孢杆菌(BaciIluslicheniformi) Yltl及其在防治犬腹泻病方面的应用，属于预防兽医技术领域。
背景技术：
自上世纪八十年代以来，微生态制剂作为生物兽药和饲料添加剂已广泛用于仔猪、犊牛、羔羊、家禽等动物肠炎、腹泻病的预防和治疗上。目前专门用于宠物犬的国产微生态制剂还没有问世，临床上常使用人用微生态制剂如整肠生、益菌生等来调节犬的肠道菌群平衡，但效果并不理想。国外已出现了犬用微生态产品，但由于目前微生态制剂作为食品添加剂的相关标准尚不完善，生产质量控制薄弱，一些产品达不到包装上所标示的活菌数 量，有的产品根本就不含有活菌(任普军.2006.新兽医，6 :48-50)，从而导致产品达不到治病、防病的作用，宠物用微生态制剂整体质量水平比较低，完全不能满足宠物市场快速发展的需要。从2006年I月开始，欧盟已全面禁止在动物饲料中添加抗生素(刘兴海.2007.现代畜牧兽医，5 :35-36)。随着抗生素在我国的限用，甚至禁用，该病在我国养犬业中将越来越严重。因此，开发犬用微生态制剂，不仅对生态养犬和环境治理有重要意义，而且给生物兽药业和饲料工业带来巨大的经济效益。目前许多国外学者对乳酸杆菌应用于犬的研究较多，而对芽孢杆菌应用于犬的研究不足(刘昆.2008.饲料工业，15 54-55)。益生菌(又叫微生态制剂，或微生物制剂，或微生物饲料添加剂)是最先被提出的抗生素替代品，它的作用主要在于扶植正常微生物菌群，调节生态平衡(李长强.2010.江西饲料，2 21-24)。迄今为止尚未见到有关地衣芽孢杆菌Yltl的筛选及其在防治犬腹泻病中的应用的报道。

发明内容
针对目前抗生素的滥用及禁用导致疾病很难治愈的情况以及犬感染细菌导致腹泻病后难以治愈或无法治疗等问题，本发明的目的是提供一株具有耐酸、耐胆盐、抑菌效果好的地衣芽孢杆菌Yltl;同时也提供该地衣芽孢杆菌Yltl在兽药或饲料中的应用，可用以预防和治疗犬腹泻病并调整犬肠道微生态平衡，提高肠道微生物多样性。本发明参考益生菌可用于临床上预防和治疗动物疾病的思维，从健康犬粪样中筛选出耐酸、耐胆盐，抑菌效果好的地衣芽孢杆菌Yltl及菌剂，然后利用该菌剂在兽药或犬日粮中的应用，证明添加本发明菌剂Yltl后，可以预防和治疗犬腹泻病；同时发现菌剂Yltl的应用能显著提高犬肠道微生物的多样性，调整犬肠道微生态平衡，改善犬生长性能。具体讲，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是本发明获得具有耐酸、耐胆盐，抑菌效果好的地衣芽孢杆菌Yltl的方法是(见图1)采集健康犬粪样，用蒸馏水稀释后，用不同筛选培养基进行分离培养和鉴定，得到一株对葡萄球菌、大肠杆菌CVCC2060、绿脓杆菌、大肠杆菌ATCC25922、沙门氏菌339有显著抑制作用的菌株Yltl，然后进行耐酸、耐胆盐试验。通过PCR扩增出菌株112的163 rDNA片段，经测序获得目的基因序列。用美国生物信息学中心(NCBI)的BLAST程序对所初步获得的菌株H2 的 16S rDNA 序列进行登录，获得登录号为 FJ549021 (GenBank(Http://www. ncb1. nlm.nih. gov/blast/),与已收录的序列进行核苷酸同源性比较。经过微生物学分类鉴定,确定该分离的菌株Ylt!为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) Yltl,该菌株已于2011年4月20日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为:CCTCC NO M2011134o本发明地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformi)Yltl(以下简称为“地衣芽孢杆菌CCTCC 2011134”或“地衣芽孢杆菌Y1(l”)按照常规甘油冷冻方法保藏。本发明也提供本发明“地衣芽孢杆菌CCTCC 2011134”在兽药或饲料中的应用。采用农业微生物常规操作方法将本发明制备成含“地衣芽孢杆菌CCTCC2011134”活菌含量不低于1.0X109cfu/g范围的微生物制剂(以下简称“菌剂”)，以不低于0. 1%比例添加在犬日粮中，使其在犬日粮中活菌含量不低于1. OX 106cfu/g，可以预防和治疗犬腹泻病，促进其肠道内正常生理性厌氧菌的生长，调整肠道菌群失调，恢复肠道功能，提高犬肠道 微生物多样性，增强机体免疫器官指数，改善犬的生长性能。本发明“地衣芽孢杆菌CCTCC2011134”菌剂还可参照北京顺达四海生物药业有限公司公开的发明专利(公开号为CN102120972A，发明名称地衣芽孢杆菌菌粉及微生态制剂的制备方法)所介绍的方法生产，应用后同样能获得相同效果。本发明具有以下效果(I)本发明“地衣芽孢杆菌CCTCC 2011134”具有耐酸、耐胆盐，抑菌效果好，可用于治疗由大肠杆菌、沙门氏菌等引起的犬腹泻病并提高犬肠道微生物多样性。(2)本发明“地衣芽孢杆菌CCTCC 2011134”可直接在兽药或饲料中应用；也可制成微生态制剂，作为生物兽药和犬食品添加剂使用，比如添加于犬日粮中使用，可有效预防和治疗由大肠杆菌、沙门氏菌等引起的腹泻病，促进其肠道内正常生理性厌氧菌的生长，调整肠道菌群失调，恢复肠道功能，提高犬肠道微生物多样性及免疫器官指数，改善犬生长性能。这会给生物兽药业和饲料工业带来良好的经济效益。本发明适用于饲料厂和规模化养犬场。


图1为本发明的技术流程图。图2为本发明“地衣芽孢杆菌CCTCC 2011134”的抑菌试验结果图，其中A，B，C，D，E分别为本发明“地衣芽孢杆菌CCTCC 2011134”对大肠杆菌CVCC2060、ATCC25922，金黄色葡萄球菌，绿脓杆菌和沙门氏菌抑菌效果。图3为本发明“地衣芽孢杆菌CCTCC 2011134”总DNA的2%琼脂糖凝胶电泳检测图。图4为本发明“地衣芽孢杆菌CCTCC 2011134” 16S rRNAPCR产物的1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测图。图5为从Genbank里搜索出芽孢杆菌属内12个不同种的16S rRNA序列建立芽孢杆菌属系统发育树图。
图6为本发明“地衣芽孢杆菌CCTCC 2011134”治疗感染腹泻病幼犬粪样细菌总DNA的0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测结果图。该图中，Marker为入-1lldigest，样品在23kb处都有条带。图7为本发明“地衣芽孢杆菌CCTCC 2011134”治疗感染腹泻病犬粪样细菌16SrRNA V3区PCR扩增结果。该图中，Marker为D2000，PCR扩增得到200bp左右的16S rRNAV3区片段。图8-图9为本发明“地衣芽孢杆菌CCTCC 2011134”对各组幼犬处理0日粪样菌群的DGGE图谱、聚类分析图。图10-图11为本发明“地衣 芽孢杆菌CCTCC 2011134”对各组幼犬处理9日粪样菌群的DGGE图谱、聚类分析图。图12-图13为本发明“地衣芽孢杆菌CCTCC 2011134”对试验组3幼犬粪样菌群的DGGE图谱、聚类分析图。图14-图15为本发明“地衣芽孢杆菌CCTCC 2011134”对试验组4幼犬粪样菌群的DGGE图谱、聚类分析图。图16为本发明“地衣芽孢杆菌CCTCC 2011134”对试验幼犬粪样微生物群落多样性的影响图。
具体实施例方式实施例1:本发明“地衣芽孢杆菌CCTCC 2011134”的获取与鉴定，见图11、本发明“地衣芽孢杆菌CCTCC 2011134” (即地衣芽孢杆菌Yltl)的分离、获取1.1菌株Yltl的分离采集位于中国四川省雅安市内常见的、家养的健康宠物犬的新鲜粪样，立即送实验室检测。取新鲜粪样0. 5g，放入加有49. 5ml生理盐水并带有玻璃珠的三角瓶中，摇床37°C震荡20min，然后60°C恒温水浴20min。取0. 5ml稀释粪液做十倍递减稀释到10_5。从10_3 10_5各稀释度取100 U L涂布于普通营养琼脂培养基，37°C恒温培养12h。镜检培养基上的单个菌落。挑取芽孢杆菌单菌落在普通营养琼脂平板上画线培养，每个单菌落重复平板画线2 3次，直到得到纯的菌株Yltl即本发明地衣芽孢杆菌Y1(l。将得到的菌株Yltl接种于营养琼脂斜面，保存备用。1. 2耐酸试验将筛选到的菌株Yltl培养过夜，离心收集菌体(4000r/min，10min,4°C ) ；0. 25%生理盐水漂洗一次后离心；悬浮于0. OSM磷酸缓冲液_pH2. 0中，37°C培养I 3h，检测培养期间活菌数的变化。试验结果显示，pH2. 0的缓冲液中3小时后存活率达到80. 32% (见表I)。表明本发明菌株Yltl具有较强的耐酸性。表I菌株Yltl耐酸实验结果 LogltlCFUAiL
1 OhIh2h3h 存活率(%)
Y10 8.99 7.68 7.43 7.22 80.321. 3耐胆盐试验
将筛选到的菌株Yltl培养过夜，离心收集菌体(4000r/min，10min,4°C ) ；0. 25%生理盐水漂洗一次后离心；悬浮于与初培养基等体积的含1%胆盐的生理盐水中，37°C作用6h ;检测活菌数的变化率。试验结果显示，菌株Yltl在6小时后存活率达94. 11% (见表2)。这表明本发明菌株Yltl具有较强的胆盐耐受性。表2菌株Yltl的胆盐耐受结果 Log1(lCFU/mL
权利要求
1.一株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)Yltl,其特征在于该菌株耐酸、耐胆盐、抑菌效果好，且能较显著改善犬肠道环境，促进微生态平衡从而降低腹泻率。该菌株已于2011年4月20日由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCC NO M2011134。
2.权利要求1所述的菌株或含有该菌株的微生物制剂在防治犬腹泻病方面的应用。
全文摘要
本发明公开了一株耐酸、耐胆盐、抑菌效果好的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)Y10及其在防治犬肠炎、腹泻病方面的应用。该菌株通过分离、筛选和鉴定而获得，保藏编号为CCTCC NOM2011134；该地衣芽孢杆菌Y10可制成微生态制剂，作为兽药和犬食品添加剂使用，调整肠道菌群失调，提高犬肠道微生物多样性及免疫器官指数，改善犬生长性能，有效防治犬腹泻病，为预防犬肠道细菌性疾病提供新的思路，同时也为犬源微生态制剂的发展提供可行的备用菌种。本发明适用于饲料厂和规模化养犬场。
文档编号A61P1/12GK102994416SQ20121038762
公开日2013年3月27日 申请日期2012年10月15日 优先权日2012年10月15日
发明者倪学勤, 曾东, 李洁萍, 曾燕, 舒刚, 景波, 彭焕伟 申请人:四川农业大学