保持黄孢原毛平革菌菌体形态的胞外聚合物的提取方法
【专利摘要】一种保持黄孢原毛平革菌菌体形态的胞外聚合物的提取方法，包括以下步骤：（1）预处理：混合戊二醛溶液和黄孢原毛平革菌菌体，保温；将上述保温后的混合物过滤分离，无菌水冲洗，得保温后的黄孢原毛平革菌菌体；将保温后的黄孢原毛平革菌菌体和无菌水混合，保温，得混合液；（2）离心处理：将步骤（1）的混合液进行高速离心分离，得上清液；（3）透析：将步骤（2）得到的上清液放置入分子截留量为3500～7000kDa的透析袋中进行透析，得到胞外聚合物。本发明保持黄孢原毛平革菌菌体形态的胞外聚合物的提取方法具有不造成细胞破裂、菌体水解的特点，既能保持菌体原有形态，而且还能更完整的提取胞外聚合物。
【专利说明】保持黄孢原毛平革菌菌体形态的胞外聚合物的提取方法
【技术领域】[0001]本发明涉及胞外聚合物提取领域，尤其涉及一种保持黄孢原毛平革菌菌体形态的胞外聚合物的提取方法。
【背景技术】[0002]黄孢原毛平革菌由于其独特的对异生物质的处理能力，既能处理难降解有机污染物的污染，也能应用于重金属污染的治理，其逐渐成为环境生物处理技术的研究热点。胞外聚合物(EPS)是一类由微生物本身代谢所产生的具有黏性和保护作用的基质，通常附着在微生物细胞外围。胞外聚合物主要是由多聚糖类和蛋白质类物质组成，在保持微生物细胞形态、为胞外酶提供反应场所、生物体之间的相互连接，尤其在利用微生物处理污染物等方面起着重要作用。因此，有效、完整地提取黄孢原毛平革菌的胞外聚合物对于推进黄孢原毛平革菌处理污染物的胞外作用机制的研究具有重要意义。对于黄孢原毛平革菌的胞外聚合物的提取已有一些研究，但总体来看，在胞外聚合物的提取过程中黄孢原毛平革菌菌体都存在一定程度的损伤，如细胞破裂、菌体水解及扭曲变形等。
【发明内容】
[0003]本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种步骤简单、可行、有效，不造成细胞破裂、菌体水解，保持黄孢原毛平革菌菌体形态的胞外聚合物的提取方法。[0004]为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种保持黄孢原毛平革菌菌体形态的胞外聚合物的提取方法，包括以下步骤:[0005](1)预处理:混合戊二醛溶液和黄孢原毛平革菌菌体，所述戊二醛溶液的浓度优选为0.01~0.012g/mL，每Ig湿重的黄孢原毛平革菌菌体中戊二醛溶液的添加量优选为80~IOOmL,保温，戊二醛溶液和黄孢原毛平革菌菌体的保温温度为O~4°C，保温时间为4~6h ;将上述保温后的混合物过滤分离，无菌水冲洗，得保温后的黄孢原毛平革菌菌体；将保温后的黄孢原毛平革菌菌体和无菌水混合，保温，保温后的黄孢原毛平革菌菌体和无菌水的保温温度为30~35°C，保温时间为1~2h，得混合液。[0006](2)离心处理:将步骤(1)得到的混合液进行高速离心分离，得上清液，离心处理的转速控制在10000~12000rpm，离心处理的时间为10~12min。[0007](3)透析:将步骤(2)得到的上清液放置入分子截留量为3500~7000kDa的透析袋中进行透析，得到胞外聚合物，透析温度为O~4°C，透析时间为24~48h。本发明中使用的透析袋规格优选为截留分子量为3500~7000kDa，既能达到净化生物化学分析过程中的化学干扰源的目的，又使得透析过程对胞外聚合物提取量的影响达到最小，以提取更多的胞外聚合物。[0008]上述本发明的的提取方法中，黄孢原毛平革菌菌体的制备方法可采用如下步骤制得，将黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)菌株(如黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium) BKMF-1767菌株，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC AF96007,市购)接种于土豆琼脂培养基，在25~30°C的温度条件下培养5~7天；刮取上述土豆琼脂培养基上的孢子溶于无菌水中制成孢子悬液并接种到液体培养基，在30~35°C的温度、120~150rpm的转速条件下振荡培养5~7天；将上述振荡培养后的菌体与培养液进行过滤分离，并用无菌水冲洗，得到黄孢原毛平革菌菌体。
[0009]上述本发明的的提取方法中，孢子悬液是黄孢原毛平革菌经过5~7天的传代培养后产生的孢子制成的悬液。
[0010]上述本发明的的提取方法中，振荡培养后的菌体是孢子悬液经过5~7天的振荡培养生长至对数期中后期的菌体。
[0011]步骤(1)中无菌水的冲洗次数为I~2次，无菌水冲洗的目的在于去除吸附在黄孢原毛平革菌菌体上多余的戊二醛溶液，避免其对胞外聚合物中各类物质的测定产生影响。
[0012]黄孢原毛平革菌菌体培养过程中无菌水的冲洗次数为I~2次，无菌水冲洗的目的在于去除吸附在黄孢原毛平革菌菌体上的液体培养基，避免其中的糖类物质对提取到的胞外聚合物产生影响。
[0013]与现有技术相比，本发明的优点在于:
[0014]本发明利用了戊二醛溶液保护菌体形态的作用，具体来说是先用戊二醛溶液对黄孢原毛平革菌菌体进行预处理，再提取胞外聚合物，解决了现有提取胞外聚合物的方法中存在的易造成的细胞破裂、菌体水解及扭曲变形等菌体受损问题。本发明不仅对黄孢原毛平革菌菌体形态具有保护作用，能够保持其原有形态，而且还能更完整、最大量的提取到其胞外聚合物。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为本发明的不做任 何处理的黄孢原毛平革菌菌体的微观结构扫描电镜图。
[0016]图2为黄孢原毛平革菌菌体经无菌水预处理，提取胞外聚合物后的微观结构扫描电镜图。
[0017]图3为黄孢原毛平革菌菌体经磷酸盐缓冲液(PBS)预处理，提取胞外聚合物后的微观结构扫描电镜图。
[0018]图4为黄孢原毛平革菌菌体经戊二醛溶液预处理，提取胞外聚合物后的微观结构扫描电镜图。
[0019]图5为黄孢原毛平革菌菌体经无菌水、磷酸盐缓冲液(PBS)、戊二醛溶液预处理后分别提取到的胞外聚合物溶液中的蛋白质、糖类及DNA含量的柱状对比图。
【具体实施方式】
[0020]以下通过具体实施例和说明书附图对本发明进行更详细的说明。实施例仅是对本发明的一种说明，而不构成对本发明的限制。
[0021]实施例1:
[0022]将黄抱原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)菌株(如 BKMF-1767 菌株，中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC AF96007，市购)接种于土豆琼脂培养基，在25°C的温度条件下培养7天；刮取上述土豆琼脂培养基上的孢子溶于无菌水中制成孢子悬液并接种到液体培养基，在30°C的温度、150rpm的转速条件下振荡培养5天；将上述振荡培养后的菌体与培养液进行过滤分离，并用无菌水冲洗，得到黄孢原毛平革菌菌体。
[0023]取50mL、0.01g/mL戊二醛溶液混合0.5g湿重的黄孢原毛平革菌菌体，保温，其中保温温度为4°C，保温时间为5h ;将保温后的混合物过滤分离，用无菌水冲洗2遍，再加入到无菌水中，在30°C下水浴保温lh，得到保温后的黄孢原毛平革菌菌体和无菌水的混合液；将上述混合液在转速为1000Orpm的条件下进行高速离心分离，离心时间为lOmin，得到上清液；将上述得到的上清液经过3500kDa的透析袋透析48h，透析温度为4°C，即得到黄孢原毛平革菌的胞外聚合物。
[0024]实施例2:
[0025]将黄抱原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)菌株(如 BKMF-1767 菌株，中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC AF96007，市购)接种于土豆琼脂培养基，在30°C的温度条件下培养5天；刮取上述土豆琼脂培养基上的孢子溶于无菌水中制成孢子悬液并接种到液体培养基，在35 °C的温度、120rpm的转速条件下振荡培养7天；将上述振荡培养后的菌体与培养液进行过滤分离，并用无菌水冲洗，得到黄孢原毛平革菌菌体。
[0026]取100mL、0.012g/mL戊二醛溶液混合1.25g湿重的黄孢原毛平革菌菌体，保温，其中保温温度为0°c，保温时间为6h ;将保温后的混合物过滤分离，用无菌水冲洗I遍，再加入到无菌水中，在35°C下水浴保温2h，得到保温后的黄孢原毛平革菌菌体和无菌水的混合液；将上述混合液在转速为12000rpm的条件下进行高速离心分离，离心时间为12min，得到上清液；将上述得到的上清液经过7000kDa的透析袋透析24h，透析温度为(TC，即得到黄孢原毛平革菌的胞外聚合物。
[0027]实施例3:`[0028]将黄抱原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)菌株(如 BKMF-1767 菌株，中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC AF96007，市购)接种于土豆琼脂培养基，在25°C的温度条件下培养6天；刮取上述土豆琼脂培养基上的孢子溶于无菌水中制成孢子悬液并接种到液体培养基，在32°C的温度、140rpm的转速条件下振荡培养6天；将上述振荡培养后的菌体与培养液进行过滤分离，并用无菌水冲洗，得到黄孢原毛平革菌菌体。
[0029]取150mL、0.01g/mL戊二醛溶液混合1.5g湿重的黄孢原毛平革菌菌体，保温，保温温度为2V，保温时间为4h ;将保温后的混合物过滤分离，用无菌水冲洗2遍，再加入到无菌水中，在35°C下水浴保温lh，得到保温后的黄孢原毛平革菌菌体和无菌水的混合液；将上述混合液在转速为IlOOOrpm的条件下进行高速离心分离，离心时间为llmin，得到上清液；将上述得到的上清液经过5000kDa的透析袋透析36h，透析温度为2°C，即得到黄孢原毛平革菌的胞外聚合物。
[0030]下面通过对比分析来说明本发明提取胞外聚合物的优点。
[0031]以不做任何处理的黄孢原毛平革菌菌体为对照例，然后分别采用0.01g/mL戊二醛溶液，无菌水，0.01M且pH=7.0的磷酸盐缓冲液，对原始的黄孢原毛平革菌菌体进行保温处理，其他条件和实施例1相同，得到实施例1、比较例1、比较例2。
[0032]将对照例得到的黄孢原毛平革菌菌体和实施例1、比较例1、比较例2经高速离心分离后得到的黄孢原毛平革菌菌体分别加入无菌水中，使各组黄孢原毛平革菌菌体恢复形状，然后放入冰箱在_20°C冷冻5h，再分别进行冷冻真空干燥用于菌体干重的称量及扫描电镜分析。在环境扫描电镜下，观察上述四种黄孢原毛平革菌菌体的微观结构，如图1~4所示。由图1所示，未提取胞外聚合物的黄孢原毛平革菌菌体呈饱满的圆柱丝状(对照例)。如图2所示，经无菌水预处理提取胞外聚合物后的黄孢原毛平革菌菌体则出现严重的扭曲、干瘪、变形(比较例I)。由图3所示，相比于无菌水预处理提取胞外聚合物后的菌体，磷酸盐缓冲液(PBS)对黄孢原毛平革菌菌体形态产生的影响相对小一些，但是菌体仍然存在一定程度的扭曲变形(比较例2 )。由图4所示，经戊二醛溶液预处理提取胞外聚合物后的黄孢原毛平革菌菌体仍然保持相对较饱满的圆柱丝状结构(实施例1)，这说明在黄孢原毛平革菌的胞外聚合物的提取过程中，戊二醛溶液预处理对于黄孢原毛平革菌菌体形态能起到保护作用，能够使菌体保持原有形态。
[0033]最后，用蒽酮-H2SO4比色法，以葡萄糖制备标准曲线，测定实施例1、比较例I和比较例2制备的黄孢原毛平革菌胞外聚合物中糖类物质的含量；用考马斯亮蓝法，以牛血清蛋白制备标准曲线，测定本实施例制备的黄孢原毛平革菌胞外聚合物中蛋白质的含量；用光密度法测定本实施例制备的黄孢原毛平革菌胞外聚合物中DNA的含量。测量结果如图5所示。
[0034]由图5的DNA柱状比较可以看出，在三种预处理方法中，无菌水和磷酸盐缓冲液(PBS)预处理菌体的胞外聚合物提取物中均检测到DNA，这说明在这两种预处理提取胞外聚合物的过程中黄孢原毛平革菌产生了一定程度的细胞破裂、菌体水解，其中以无菌水预处理的影响最大，检测到15.3mg/g的DNA，表示干重为Ig的菌体提取到的胞外聚合物(EPS)中含有15.3mg的DNA。其次为磷酸盐缓冲液(PBS)预处理，检测到12.lmg/g的DNA。而戊二醛溶液预处理的提取方法则没有检测到DNA，这同样进一步地证实了戊二醛溶液预处理的胞外聚合物的提取方法解决了以往提取方法中出现的细胞破裂、菌体水解等问题。三种预处理提取方法提取到的胞外聚合物中蛋白质和糖类的检测结果可以看出，实施例1、比较例I和比较例2中分别检测到相差不大的蛋白质含量，分别为30.8mg/g、34.3mg/g、36.5mg/g ;差别大的是提取到的糖类含量，戊二醛溶液预处理提取法提取到最大量的糖类物质(416.6mg/g),其次是无菌水预处理提取法(223.2mg/g),最后是磷酸盐缓冲液(PBS)预处理提取法(179.7mg/g)。由此可见，本发明所用的戊二醛溶液预处理提取法不仅对于黄孢原毛平革菌菌体形态具有保护作用，而且还能更完整地提取到胞外聚合物。
[0035]以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应该指出，对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下的改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种保持黄孢原毛平革菌菌体形态的胞外聚合物的提取方法，包括以下步骤: (1)预处理:混合戊二醛溶液和黄孢原毛平革菌菌体，保温；将上述保温后的混合物过滤分离，无菌水冲洗，得保温后的黄孢原毛平革菌菌体；将保温后的黄孢原毛平革菌菌体和无菌水混合，保温，得混合液； (2)离心处理:将步骤(1)得到的混合液进行高速离心分离，得上清液； (3)透析:将步骤(2)得到的上清液放置入分子截留量为3500~7000kDa的透析袋中进行透析，得到胞外聚合物。
2.根据权利要求书I所述的提取方法，其特征在于，所述戊二醛溶液的浓度为0.01~0.012g/mL。
3.根据权利要求书I或2所述的提取方法，其特征在于，每Ig湿重的黄孢原毛平革菌菌体中戊二醛溶液的添加量为80~100mL。
4.根据权利要求书I或2所述的提取方法，其特征在于，戊二醛溶液和黄孢原毛平革菌菌体的保温温度为O~4°C。
5.根据权利要求书I或2所述的提取方法，其特征在于，戊二醛溶液和黄孢原毛平革菌菌体的保温时间为4~6h。
6.根据权利要求书I或2所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(1)中保温后的黄孢原毛平革菌菌体和无菌水的保温温度为30~35°C，保温时间为I~2h。
7.根据权利要求书I或2所述的提取方法，其特征在于，步骤(2)的高速离心分离的转速控制在10000~12000rpm，离心时间为10~12min。
8.根据权利要求书I或2所述的提取方法，其特征在于，步骤(3)的透析温度为O~4°C，透析时间为24~48h。
【文档编号】C07K1/14GK103554214SQ201310503190
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月23日 优先权日:2013年10月23日
【发明者】曾光明, 李宁杰, 黄丹莲, 刘亮, 赖萃, 赵美花, 黄超, 危臻, 许飘, 张辰, 李芳玲 申请人:湖南大学