专利名称：重金属诱导下黄孢原毛平革菌胞外分泌蛋白的提取方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质提取领域，尤其涉及一种重金属诱导下黄孢原毛平革菌胞外分泌蛋白的提取方法。
背景技术：
环境中的重金属通过食物链而在生物体内富集并持久存在，并日益威胁生态环境和人类健康。利用微生物处理工业废水中的重金属，具有费用低、对环境影响小、效率高等优点，越来越受到广大科技人员的关注。白腐真菌对各种异生物质有广谱而独特的降解能力和降解机制，对溶液中重金属离子也有良好的吸附效果。黄孢原毛平革菌是一种研究较广的白腐真菌，其胞外聚合物主要为多糖和蛋白质，特别是蛋白质中的羟基、羧基、氨基等与重金属离子的吸附与结合有重要关联。研究胞外分泌物中的蛋白质种类、功能、分子量和等电点等，来探讨黄孢原毛平革菌对重金属吸附机理具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种步骤简单、可行、 有效的对白腐真菌吸附重金属研究具有重要意义的黄孢原毛平革菌胞外分泌蛋白的提取方法。为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案一种在重金属诱导下黄孢原毛平革菌胞外分泌蛋白的提取方法，包括以下步骤(I)培养过滤分离先液态培养黄孢原毛平革菌，再加入镉离子溶液继续培养，过滤得重金属诱导后的胞外分泌液；(2)三氯乙酸(TCA)沉淀在所述胞外分泌液中加入TCA溶液，TCA溶液的添加量为所述胞外分泌液体积的1/9 1/10，沉淀过夜，经离心弃上清液，收集沉淀，得到沉淀物；(3)丙酮洗涤用丙酮溶液对所述沉淀物洗涤，离心、弃上清，(经冷冻)得到胞外分泌蛋白。上述的提取方法中，优选地，所述步骤(I)中，液态培养黄孢原毛平革菌至对数生长期中后期，加入镉离子溶液继续培养的时间为2h 4h，所述镉离子溶液的浓度为 40 μ mo I 50 μ mol。上述的提取方法中，优选地，所述步骤(2)中，离心弃上清液后，再向此上清液中加入三氯乙酸溶液，并再次经沉淀过夜、离心弃上清液后，最后收集全部沉淀，得到所述沉淀物。上述的提取方法，所述步骤(2)中，加入的TCA溶液的质量-体积百分浓度优选为 98% 100% (w/ν) ο上述的提取方法，所述步骤(2)中，优选地，沉淀过夜的温度为0°C 4°C，离心时的温度和转速分别为0°c 4°C和IOOOOrpm 12000rpm。
上述的提取方法，所述步骤(3)中，优选地，丙酮溶液的体积分数为80% 100%， 丙酮溶液经过低于_20°C预冷处理，并含O. 07% O. 08%的β -巯基乙醇。上述的提取方法，所述步骤(3)中，优选地，用丙酮溶液对沉淀物洗涤两次，每次洗涤的温度低于_20°C，每次洗涤的时间为5h 10h。与现有技术相比，本发明的优点为本发明的在重金属诱导下黄孢原毛平革菌胞外分泌蛋白的提取方法，简单、有效；采用质量-体积百分浓度为100%的沉淀剂TCA溶液， 能大量沉淀出蛋白，减少沉淀实验中所需处理液体体积；该方法提取得到的胞外分泌蛋白， 结合荧光差异凝胶电泳技术，可以得到差异蛋白的种类、功能、分子量、等电点等，可找出在此过程中起主要作用的特异性蛋白和基因调控，为研究重金属等逆境诱导下黄孢原毛平革菌分泌蛋白的变化及抵抗机理提供科学依据。
图I是本发明实施例的黄孢原毛平革菌对重金属镉的去除率及吸附量随时间的变化图。图2是本发明实施例的黄孢原毛平革菌在重金属镉诱导前、后分泌蛋白含量的变化图。图3是本发明实施例的黄孢原毛平革菌在重金属镉诱导前的蛋白质荧光差异凝胶电泳图。图4是本发明实施例的黄孢原毛平革菌在重金属镉诱导后的蛋白质荧光差异凝胶电泳图。
具体实施例方式下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步的说明。实施例一种本发明的重金属诱导下黄孢原毛平革菌胞外分泌蛋白的提取方法，包括以下步骤(I)培养过滤分离选用一黄抱原毛平革菌(如Phanerochaete chrysosporium ATTC 96007,购自武汉大学中国典型培养物中心，优选采用该菌株，但不限于此)，从斜面培养基上刮取孢子于无菌水中制成悬液，将孢子悬液接种到250mL锥形瓶中，内装有IOOmL Kirk液体培养基(灭菌)，于恒温振荡箱中培养，培养温度35°C,摇床转速为150rpm,培养后分别测得黄孢原毛平革菌在50h、55h、60h、65h、70h时间点的胞外蛋白分泌量(通过Bradford法测定)，并在这些时间点相应的投加重金属镉离子溶液(浓度为50 μ mol，调节pH 6.0)诱导4h，分别得到重金属诱导前后胞外蛋白的分泌量及重金属镉的去除率和吸附量(原子吸收测定)，结果见图I、图2和表I ;表I :黄孢原毛平革菌不同时间点分泌蛋白量及对重金属镉的去除
权利要求
1.一种重金属诱导下黄孢原毛平革菌胞外分泌蛋白的提取方法，其特征在于，包括以下步骤(1)培养过滤分离先液态培养黄孢原毛平革菌，再加入镉离子溶液继续培养，过滤得重金属诱导后的胞外分泌液；(2)三氯乙酸沉淀在所述胞外分泌液中加入三氯乙酸溶液，其添加量为所述胞外分泌液体积的1/9 1/10，沉淀过夜，经离心弃上清液，收集沉淀，得到沉淀物；(3)丙酮洗涤用丙酮溶液对所述沉淀物洗涤，离心、弃上清，得到胞外分泌蛋白。
2.根据权利要求I所述的提取方法，其特征在于所述步骤(I)中，液态培养黄孢原毛平革菌至对数生长期中后期，加入镉离子溶液继续培养的时间为2h 4h，所述镉离子溶液的浓度为40 μ mo I 50 μ mol。
3.根据权利要求I或2所述的提取方法，其特征在于所述步骤(2)中，离心弃上清液后，再向此上清液中加入三氯乙酸溶液，并再次经沉淀过夜、离心弃上清液后，最后收集全部沉淀，得到所述沉淀物。
4.根据权利要求I或2所述的提取方法，其特征在于所述步骤(2)中，加入的三氯乙酸溶液质量-体积百分浓度为98% 100%。
5.根据权利要求I或2所述的提取方法，其特征在于所述步骤(2)中，沉淀过夜的温度为(TC 4°C，离心时的温度和转速分别为(TC 4°C和IOOOOrpm 12000rpm。
6.根据权利要求I或2所述的提取方法，其特征在于所述步骤(3)中，丙酮溶液的体积分数为80% 100%，丙酮溶液经过低于_20°C预冷处理，并含O. 07% O. 08%的β -巯基乙醇。
7.根据权利要求I或2所述的提取方法，其特征在于所述步骤(3)中，用丙酮溶液对沉淀物洗涤两次，每次洗涤的温度低于_20°C，每次洗涤的时间为5h 10h。
全文摘要
本发明公开了一种重金属诱导下黄孢原毛平革菌胞外分泌蛋白的提取方法，包括以下步骤先液态培养黄孢原毛平革菌，再加入镉离子溶液培养，过滤得重金属诱导后的胞外分泌液；在胞外分泌液中加入高百分浓度的三氯乙酸溶液，其添加量为胞外分泌液体积的1/9～1/10，沉淀过夜，经离心弃上清液，收集沉淀，得到沉淀物；最后用丙酮溶液对沉淀物洗涤，离心、弃上清，得到胞外分泌蛋白。本发明的提取方法简单、有效，能大量沉淀出蛋白，减少沉淀中所需处理液体体积。
文档编号C12P21/00GK102586367SQ20121003723
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月17日 优先权日2012年2月17日
发明者周颖, 官嵩, 尚翠, 曾光明, 李欢可, 杨静, 贺建敏, 邹正军, 陈安伟, 陈桂秋 申请人:湖南大学