一种借助细胞穿透肽和小孢子培养建立大白菜遗传转化体系的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物细胞工程技术和分子生物学领域，具体涉及一种在小孢子培养过程中结合细胞穿透肽的穿膜功能建立大白菜遗传转化体系的方法。
【背景技术】
[0002]大白菜是我国最重要的蔬菜作物之一。随着大白菜的基因组序列的释放，对于其功能基因组学的研宄越来越引起人们的重视，构建大白菜高效遗传转化体系在大白菜基因功能验证方面具有重要作用。
[0003]在转基因大白菜的研宄方面，国内外众多学者借助于组织培养等手段已经建立起了大白菜的遗传转化体系。但是此类转化方法存在着转化效率低、实验周期长等不足。
[0004]细胞穿透肽是一类能携带大分子物质进入细胞的短肽(一般不超过30个氨基酸)，其跨膜能力不依赖经典的胞吞作用，被认为是一种理想的运载工具。它具有一些其他运载工具无法比拟的优点:低浓度条件下，可以穿过细胞膜进入细胞并且不会对膜造成明显破坏和损伤；能介导各种物质包括小分子、核酸、蛋白多肽以及纳米粒子等入胞；高效、低毒。如果将细胞穿透肽和小孢子培养技术结合起来，就能够避免农杆菌侵染的环节，直接可以利用细胞穿透肽将目的基因导入把基因组，省却了很多的实验环节。这类渗透肽的分子量非常小，很多的商业公司可提供合成业务。同时，它又巧妙利用了植物的小孢子培养技术，在游离小孢子加倍之前，将目的基因导入，借助游离小孢子的自然加倍现象，直接获得纯合稳定的转基因植株。
[0005]
【发明内容】
[0006]本发明的目的是创建一种借助细胞穿透肽和小孢子培养建立大白菜遗传转化体系的方法，将细胞穿透肽和小孢子培养技术相结合，快速获得纯合的大白菜转化植株。
[0007]本发明提供的技术方案如下:
过程包括:
(1)进行分离纯化小孢子:在大白菜开花期，选取其长度为2-4mm的未开放花蕾(小孢子发育期为单核晚期至二核早期)，花蕾在超净工作台内经75%乙醇溶液，0.1% HgCl2S液消毒后，再用无菌水冲洗3次；将消毒后的花蕾在蔗糖浓度为130g.Ι^，ΡΗ值为5.8的B5培养基中进行分离纯化，收集得到的沉淀物即为纯净小孢子；将纯化后的小孢子用NLN-13培养基稀释后分装入直径60 mm的无菌培养皿内，置入33°C恒温箱中，热激预处理24h ;
其中，NLN-13培养基为含130g.L—1蔗糖，添加激素0.05mg.L ―1 6-BA ( 6-苄氨基腺嘌呤)和0.05mg.L4 NAA ( α -萘乙酸)，PH值为5.8的NLN-13培养基；
(2)转染小孢子的基因表达组件的获得:将载体pBI221-GFP质粒DNA转入大肠杆菌DH5 α感受态细胞中，并在添加相应抗生素的培养基上进行扩大培养；以2PL菌液为模板，用引物 pi GATGGTTAGAGAGGCTTACGCAG,p2 CACAATAAAGTGACAGATAGCTGGG，p3 AGT T CA CCTTGA TGC CGTTC和p4 GTG CTT CA G CCG CTACCC进行PCR扩增，再用紫外凝胶成像系统拍照鉴定；使用天根无内毒素质粒大提试剂盒进行质粒DNA提取，将质粒DNA利用限制性内切酶进行酶切反应；采用天根琼脂糖凝胶回收试剂盒回收用于转染的目的DNA表达片段;
(3)获取用于小孢子转染的体外复合物:将目的DNA表达片段与细胞穿透肽按照1:4的比例混合，室温反应15min后再加入4PL无RNase的DNaseI反应15min，立即放置冰上终止反应；以未加CPP的DNA片段作为空白对照；然后用DNA纯化试剂盒回收反应产物，用
I%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。
[0008](4)小孢子转染与培养过程:目的DNA表达片段与细胞穿透肽按照1:4的比例混合反应后，将反应混合物添加到经热激预处理的小孢子悬浮液中，再置于33°C恒温箱中继续热激处理24h，最后转移至25°C培养箱暗培养。将得到的胚状体转接到MS培养基上进一步培养获得小孢子再生植株。
[0009]诱导再生植株的MS培养基为含30g.L—1蔗糖，7.5g.L ―1琼脂，pH值为5.8，未添加任何激素的MS培养基；诱导再生植株生根的MS培养基为含30g.L—1蔗糖，5.5g.L ―1琼脂，0.1mg.L-1 NAA，pH 值为 5.8 的 MS 培养基；
(5 )对再生植株进行转基因鉴定:在再生植株继代培养的过程中，于超净工作台中取出再生植株的叶片，利用新型植物基因组DNA提取试剂盒提取大白菜转化与未转化植株的基因组总 DNA，然后通过 1PL 的 PCR反应体系(0.5μ?模板DNA，?μ?ΙΟΧ buffer，0.8PLdNTPs，0.5μ?引物plp2或p3p4，0.2PLTaq DNA聚合酶)进行扩增反应，产物经I %的琼脂糖凝胶电泳分离，紫外凝胶成像系统检测；
于超净工作台中，从三角瓶里取PCR阳性再生植株的嫩叶，采用新型植物RNA提取试剂盒提取大白菜基因组总RNA，然后进行反转录PCR扩增反应，产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分离，紫外凝胶成像系统检测。
[0010]于超净工作台中取出阳性与非转化再生植株的幼叶，用Fluor Cam便携式ChI/GFP荧光仪和激光共聚焦显微镜对PCR阳性转化植株进行检测；
采用罗氏地高辛标记试剂盒II对阳性植株进行Southern Blot检测；
(6)利用流式细胞仪对再生植株进行倍性鉴定:取直径为l_2cm大小的新鲜嫩叶放入培养皿内，加入2.0 mL Chopping Buffer缓冲液(15 mmol.L—1三羟甲基氨基甲烷，2mmol.L—1乙二胺四乙酸二钠，0.5 mmol.L ―1精胺，80 mmol.L勺氯化钾，20 mmol.L-1氯化钠，0.1% [v/v]聚乙二醇辛基苯基醚和15 mmol.L—1 二巯基乙醇，pH 7.5)，用手术剪刀将叶片剪碎，吸取上清液，用300目筛网将样品过滤到离心管内，100rpm离心lOmin，离心后弃上清，沉淀加ImL PI (碘化丙啶)染液，混匀避光染色15min后，将样品用500目筛网过滤到上样管中，混匀上机检测，约20s后分析仪自动形成代表该样品倍性的DNA含量峰值图；以已知二倍体的材料为对照，使对照的DNA吸收峰处在200道(X轴)位置，每个待测植株分别测定3次，DNA吸收峰值处在200道的样本即为二倍体，而峰值处在100为单倍体，既有200峰值也有400峰值或者既有400峰值也有800峰值的则为嵌合体。
[0011]本发明的积极效果:
(I)游离小孢子培养本身具有快速获得目标性状、缩短育种年限、降低育种成本等优点。将其与细胞穿透肽相结合，获得的后代群体大，基因型纯合，将会提高转化频率。
[0012](2)所用的转化材料为小孢子DH系，是遗传意义上的纯系。如果获得转基因植株，转化与非转化植株之间遗传背景完全一致，且完全纯合，便于后代的检测，进而进行基因功能的验证。
[0013](3)细胞穿透肽和质粒DNA之间通过一定的比例就可以结合从而形成一种复合物，向游离小孢子悬浮液中添加这些复合物后，胚胎发生基本不受影响。
[0014](4)本发明获得高效的大白菜遗传转化体系，不仅为大白菜育种研宄提供了新的研宄平台，也为大白菜功能基因组学的研宄提供了良好的基础。
【附图说明】
[0015]图1:DNase I保护分析检测结果。
[0016]图中:ck:阴性对照；1: DNA(6F乃；2:DNA与细胞穿透肽的复合物；M: D5000 图2:转染后的小孢子培养过程。
[0017]图中:Α:转染后得到的胚状体；B:胚状体转入固体MS培养基进行成苗；C:再生植株的继代培养；D:再生植株的生根情况
图3:大白菜基因组总DNA琼脂糖电泳检测结果。
[0018]图4:转化再生植株的部分PCR扩增检测结果。
[0019]图中:η:非转化植株；P:质粒DNA
图5:大白菜基因组总RN