专利名称：用于分离和处理自身免疫性t细胞的拟肽配体的制作方法
用于分离和处理自身免疫性T细胞的拟肽配体本申请要求2009年5月四日提交的美国临时专利申请编号61/182，368和2009 年11月12日提交的编号61/260，608的优先权，以上每篇文献以其整体作为参考并入本文。本发明是在国家心肺和血液研究所的资助号No. N01-HV28185以及国家健康研究所的资助号NO.DP10D00066301的政府支持下进行的。政府对本发明具有一定的权利。
背景技术：
1.发明领域本发明一般性地涉及分子生物学、免疫学和医学领域。更具体地，它涉及对被自身免疫性T细胞所识别的拟肽的鉴定。这些拟肽可用于鉴定患有自身免疫病或具有患自身免疫病风险的对象，以及可用于靶向这些细胞以进行去除、抑制或破坏。2.相关技术的说明多种自身免疫病的分子基础仍是未知的。部分地由于此分子水平上认识的缺乏， 开发自身免疫病诊断试剂和有效治疗的现有技术远未达到最佳。例如，尚没有用于诊断大部分自身免疫病的高度可靠的血清蛋白标志物。几乎没有例外，用于治疗这些病况的药物， 或者是抑制自身免疫反应本身的下游事件(如炎症)，或者是非选择性地试图调节或抑制整个免疫系统(Hemmer & Hartung，2007)，其具有显著的不希望的副作用。对于诊断和治疗应用，理想地，希望具有下述分子直接靶向自身反应性B细胞(和它们所产生的抗体)和 T细胞，但忽略识别外源抗原的B和T细胞。这些分子可用作诊断剂和研究工具，用以检测和富集自身免疫抗体、B细胞和T细胞。另外，这些分子可用作新药物开发项目的基础，其目的在于消除这些自身反应性细胞而不影响免疫系统的正常功能。因此，对于这些疾病来说，仍需要(i)准确并且客观，(ii)简单并且可重复，和 (iii)在早期和晚期事件中均有用的诊断过程。发明简述本发明提供了使用合成分子的方法，所述合成分子即作为特定生理状态之生物标志物的与配体结合部分(如复杂生物混合物中所存在的蛋白质、核酸、碳水化合物或非粘附细胞)相结合的配体。在某些方面，所述配体为拟肽。因此，根据本发明，提供了鉴定被自身免疫性T细胞所特异性识别的配体或拟肽的方法，其包括(a)提供来自健康对象的第一 T细胞群，其中所述群由第一可检测标记物所标记；(b)提供来自患自身免疫病对象的第二 T细胞群，其中所述群由第二可检测标记物所标记；(c)将所述第一和第二 T细胞群与多个所述候选拟肽相接触；和(d)评价所述第一和第二 T细胞群与所述候选拟肽的结合，其中如果所述拟肽与所述第二 T细胞群结合但是不与所述第一 T细胞群结合，则自身免疫细胞识别所述拟肽，而健康T细胞不识别。所述自身免疫病可以是多发性硬化或类风湿性关节炎。所述配体或拟肽可以是3 聚体、4聚体、5聚体、6聚体、7聚体、8聚体、9聚体或10聚体。所述第一和第二标记物可以是发荧光的或化学发光的，或量子点。所述拟肽可以与支持物结合，如珠、芯片、滤器、蘸棒(dipstick)、膜、聚合物基质或孔。所述接触步骤可包括使所述支持物与所述第一和第二 T 细胞群同时接触。所述T细胞群可包括CD4+T细胞。所述对象可以是人或鼠。在另一个实施方案中，提供了从患有自身免疫病的对象中除去自身免疫性T细胞的方法，其包括(a)提供与自身免疫性T细胞特异性结合的配体或拟肽，其中所述配体或拟肽与支持物结合；(b)将来自所述对象的含有T细胞的样品与所述结合支持物的拟肽接触足够的时间以允许自身免疫性T细胞与所述结合支持物的配体或拟肽结合；和(c)将所述支持物与所述样品分离。该方法还可以包含将步骤(c)的样品返回到所述对象。自身免疫病可以是多发性硬化或类风湿性关节炎。配体或拟肽可以是3聚体、4聚体、5聚体、6聚体、7聚体、8聚体、9聚体或10聚体。 支持物可以是珠、芯片、滤器、蘸棒、膜、聚合物基质或孔。所述样品可以是血液、脑脊液或精液。在样品为血液时，它可得自所述对象、经离体处理并返回到所述对象，以及另外，可在闭合回路中将血液灌注通过所述结合支持物的配体或拟肽并返回至所述对象。所述方法还可包括从所述对象获得所述样品。对象可以是人或鼠。在另一个实施方案中，提供了杀死从患自身免疫病对象中获得的自身免疫性T细胞的方法，其包括(a)提供与自身免疫性T细胞特异性结合的配体或拟肽，其中所述配体或拟肽与毒素缀合；和(b)将来自所述对象的含有T细胞的样品与所述缀合物接触足够的时间以允许至少一种自身免疫性T细胞与所述缀合物相结合，其中所述缀合物导致所述自身免疫性T细胞死亡。可以对样品进行离体处理，并且所述方法还可包括将所述样品返回到所述对象。所述自身免疫病可以是多发性硬化或类风湿性关节炎。所述配体或拟肽可以是3聚体、4聚体、5聚体、6聚体、7聚体、8聚体、9聚体或10 聚体。所述毒素可以是蓖麻毒素、白喉毒素或霍乱毒素。作为另外一种选择，所述毒素可以是光活化毒素，如三联吡啶基钌(II)，并且步骤(b)还可包括将所述样品暴露于可见光。所述样品可以是血液、脑脊液或精液。所述方法还可包括从所述对象获得所述样品。所述对象可以是人或鼠。在另一个实施方案中，提供了杀死从患自身免疫病对象获得的或其中的自身免疫性T细胞的方法，其包括(a)提供与自身免疫性T细胞特异地结合的配体或拟肽，其中所述配体或拟肽与含有IgG Fc的分子相缀合；和(b)将自身免疫性T细胞群与所述缀合物接触足够的时间以允许至少一个自身免疫性T细胞与所述缀合物结合，其中所述缀合物将免疫效应物募集至所述自身免疫性T细胞，从而导致其死亡。可以对自身免疫性T细胞群进行离体处理，并且所述方法还可包括将步骤(b)的样品返回到所述对象。所述自身免疫病可以是多发性硬化或类风湿性关节炎。所述配体或拟肽可以是3聚体、4聚体、5聚体、6聚体、7聚体、8聚体、9聚体或10 聚体。含有IgG Fc的分子可以是抗体、单链抗体或Fc片段，例如抗体或单链抗体，以及所述配体或拟肽与所述抗体的抗原结合位点或者缺少IgG可变区的Fc片段相连接，以及所述配体或拟肽与所述Fc片段的羧基端相连接。所述样品可以是血液、脑脊液或精液。所述方法还可以包括从所述对象获得所述样品。所述对象可以是人或鼠。在某些实施方案，本发明的化合物具有下式，包括其可药用盐化学式II
权利要求
1.鉴定被自身免疫性T细胞特异性识别的配体的方法，其包括(a)提供来自健康对象的第一T细胞群，其中所述群由第一可检测标记物所标记；(b)提供来自患自身免疫病对象的第二T细胞群，其中所述群由第二可检测标记物所标记；(c)将所述第一和第二T细胞群与多个候选配体相接触；和(d)评价所述第一和第二T细胞群与所述候选配体的结合，其中如果所述配体与所述第二 T细胞群结合但是不与所述第一 T细胞群结合，则自身免疫性T细胞识别所述配体而健康T细胞不识别。
2.根据权利要求1的方法，其中所述自身免疫病是多发性硬化或类风湿性关节炎。
3.根据权利要求1的方法，其中所述配体是3聚体、4聚体、5聚体、6聚体、7聚体、8聚体、9聚体或10聚体。
4.根据权利要求1的方法，其中所述第一和第二标记物是发荧光的或化学发光的。
5.根据权利要求1的方法，其中所述第一和第二标记物是量子点。
6.根据权利要求1的方法，其中所述配体与支持物结合。
7.根据权利要求6的方法，其中所述支持物是珠、芯片、滤器、蘸棒、膜、聚合物基质或孔。
8.根据权利要求7的方法，其中接触包括使所述支持物与所述第一和第二T细胞群同时接触。
9.根据权利要求1的方法，其中所述T细胞群包括CD4+T细胞。
10.根据权利要求1的方法，其中所述对象是人或鼠。
11.从患有自身免疫病的对象中除去自身免疫性T细胞的方法，其包括(a)提供与自身免疫性T细胞特异性结合的配体，其中所述配体与支持物结合；(b)将来自所述对象的含有T细胞的样品与所述结合支持物的配体接触足够的时间以允许自身免疫性T细胞与所述结合支持物的配体相结合；和(c)将所述支持物与所述样品分离。
12.根据权利要求11的方法，其还包括将步骤(c)的样品返回到所述对象。
13.根据权利要求11的方法，其中所述自身免疫病是多发性硬化或类风湿性关节炎。
14.根据权利要求11的方法，其中所述配体是3聚体、4聚体、5聚体、6聚体、7聚体、8 聚体、9聚体或10聚体。
15.根据权利要求11的方法，其中所述支持物是珠、芯片、滤器、蘸棒、膜、聚合物基质或孑L。
16.根据权利要求11的方法，其中所述样品是血液、脑脊液或精液。
17.根据权利要求16的方法，其中所述样品是血液，所述血液获得自所述对象，经离体处理并返回到所述对象。
18.根据权利要求17的方法，其中在闭合回路中将所述血液灌注通过所述结合支持物的配体并返回到所述对象。
19.根据权利要求11的方法，其还包括从所述对象获得所述样品。
20.根据权利要求11的方法，其中所述对象是人或鼠。
21.根据权利要求11的方法，其中所述配体是如权利要求44-63中所述的拟肽。
22.杀死从患自身免疫病对象中获得的自身免疫性T细胞的方法，其包括(a)提供与自身免疫性T细胞特异性结合的配体，其中所述配体与毒素相缀合；和(b)将来自所述对象的含T细胞的样品与所述缀合物接触足够的时间以允许至少一种自身免疫性T细胞与所述缀合物结合；和其中所述缀合物导致所述自身免疫性T细胞死亡。
23.根据权利要求22的方法，其中对所述样品进行离体处理，并且所述方法还包括将所述样品返回到所述对象。
24.根据权利要求22的方法，其中所述自身免疫病是多发性硬化或类风湿性关节炎。
25.根据权利要求22的方法，其中所述配体是3聚体、4聚体、5聚体、6聚体、7聚体、8 聚体、9聚体或10聚体。
26.根据权利要求22的方法，其中所述毒素是蓖麻毒素、白喉毒素或霍乱毒素。
27.根据权利要求22的方法，其中所述毒素是光活化毒素。
28.根据权利要求22的方法，其中所述光活化毒素是三-联吡啶基钌(II)，并且步骤 (b)还包括将所述样品暴露于可见光。
29.根据权利要求22的方法，其中所述样品是血液、脑脊液或精液。
30.根据权利要求22的方法，其还包括从所述对象获得所述样品。
31.根据权利要求22的方法，其中所述对象是人或鼠。
32.根据权利要求22的方法，其中所述配体是如权利要求44-63中所述的拟肽。
33.杀死从患自身免疫病对象中获得的或者其中的自身免疫性T细胞的方法，其包括(a)提供与自身免疫性T细胞特异性结合的配体，其中所述配体与含有IgGFc的分子缀合；和(b)将自身免疫性T细胞群与所述缀合物接触足够的时间以允许至少一种自身免疫性 T细胞与所述缀合物结合；和其中所述缀合物将免疫效应物募集至所述自身免疫性T细胞，导致其死亡。
34.根据权利要求33的方法，其中对所述自身免疫性T细胞群进行离体处理，并且所述方法还包括将步骤(b)的样品返回到所述对象中。
35.根据权利要求33的方法，其中所述自身免疫病是多发性硬化或类风湿性关节炎。
36.根据权利要求33的方法，其中所述配体是3聚体、4聚体、5聚体、6聚体、7聚体、8 聚体、9聚体或10聚体。
37.根据权利要求33的方法，其中所述含有IgGFc的分子是抗体、单链抗体或Fc片段。
38.根据权利要求37的方法，其中所述含有IgGFc的分子是抗体或单链抗体，并且所述配体与所述抗体的抗原结合位点相连接。
39.根据权利要求38的方法，其中所述含有IgGFc的分子是缺少IgG可变区的Fc片段，并且所述拟肽与所述Fc片段的羧基端相连接。
40.根据权利要求33的方法，其中所述样品是血液、脑脊液或精液。
41.根据权利要求33的方法，其还包括从所述对象获得所述样品。
42.根据权利要求33的方法，其中所述对象是人或鼠。
43.根据权利要求33的方法，其中所述配体是如权利要求44-63中的拟肽。
44.拟肽，其具有下式
45.根据权利要求44的拟肽，其中η为5。
46.根据权利要求44的拟肽，其中Rl是未取代的或NH2、OH、SH、N(C1_C6烷基)2、 0(C1-C6烷基)或S(C1-C6烷基)取代的C1-C6烷基；未取代的或NH2、OH、SH、N(C1_C6烷基)2、0(C1-C6烷基)或S(C1-C6烷基)取代的C2-C6炔基；未取代的或NH2、0H、SH、N(C1_C6 烧基)2、0(C1-C6烷基)或S(C1-C6烷基)取代的C2-C6烯基。
47.根据权利要求44的拟肽，其中Rl是末端被NH2取代的C1-C6烷基。
48.根据权利要求47的拟肽，其中Rl是4氨基丁烷。
49.根据权利要求44的拟肽，其中R2是未取代的或NH2、OH、SH、N(C1_C6烷基)2、 0(C1-C6烷基)或S(C1-C6烷基)取代的C1-C6烷基；未取代的或NH2、OH、SH、N(C1_C6烷基)2、0(C1-C6烷基)或S(C1-C6烷基)取代的C2-C6炔基；未取代的或NH2、0H、SH、N(C1_C6 烧基)2、0(C1-C6烷基)或S(C1-C6烷基)取代的C2-C6烯基。
50.根据权利要求44的拟肽，其中R2是末端被NH2取代的C1-C6烷基。
51.根据权利要求50的拟肽，其中Rl是4氨基丁烷。
52.根据权利要求44的拟肽，其中R3是C1-C6烷基、C2-C6炔基或C2-C6烯基。
53.根据权利要求52的拟肽，其中R3为异丁基。
54.根据权利要求44的拟肽，其中R4是末端被NH2基团取代的C1-C6烷基。
55.根据权利要求M的拟肽，其中R4是4氨基丁烷基团。
56.根据权利要求44的拟肽，其中R5是㈨-甲基苯甲基基团。
57.根据权利要求44的拟肽，其中R6是呋喃基基团。
58.根据权利要求44的拟肽，其中R7是末端被NH2取代的C1-C6烷基。
59.根据权利要求58的拟肽，其中R7是4氨基丁烷基团。
60.根据权利要求44的拟肽，其中R8是C1-C6烷基。
61.根据权利要求60的拟肽，其中R8是异丁基基团。
62.根据权利要求44的拟肽，其中R1、R2、R4和R7是4-氨基丁烷基团；R3和R8是异丁基基团；R5是(R)-甲基苯甲基基团；并且R6是呋喃基基团。
63.根据权利要求62的拟肽，其中R8包括末端赖氨酰基、羟基或羧基。
全文摘要
本发明提供了对来自患自身免疫病(如多发性硬化和EAE)个体的自身反应性T细胞群的鉴定。自身反应性T细胞所识别的拟肽可用于鉴定鉴定多种类型的自身免疫病，并且还可以用于对这些群进行靶向治疗。
文档编号G01N33/50GK102449481SQ201080023677
公开日2012年5月9日 申请日期2010年5月28日 优先权日2009年5月29日
发明者D·戈米卡·乌杜加马苏里亚, 安妮·R·格克, 托马斯·科达德克 申请人:奥普科健康公司, 德克萨斯大学系统董事会