纽兰格林和心脏干细胞的制作方法

专利名称：纽兰格林和心脏干细胞的制作方法
技术领域：
本发明涉及纽兰格林在体内和体外诱导哺乳动物细胞心肌生成，特别是诱导胚胎干细胞生成心肌细胞。
背景技术：
心脏(心室)肥大是对增大的心脏工作压力或需求的一种重要的适应性生理反应。肥大刺激因素作用后发生的早期细胞变化之一是线粒体合成以及伴随单个细胞大小成比例增加的肌原纤维扩增(室壁增厚)，但细胞数量没有(或极少)增加。当心室受到压力时，最初的反应是肌小节长度的增加。随后是总体肌肉量的增加。 当负荷过于严重时，心肌收缩力将减弱。在最轻微的状态，这种减弱体现为无负荷心肌收缩速度的减小或等长收缩时力量发展速率的减小。当心肌收缩力进一步减弱时，出现无负荷心肌缩短速度的更大程度下降，并伴随等长收缩肌肉力量发展及收缩长度下降。此时，循环补偿仍可由心脏扩大以及心肌质量的增加提供，它倾向于维持心室壁应力在正常水平。当收缩力继续下降时，会出现明显的充血性心衰，表现为心输出量或工作力的下降，和/或心室舒张末期容积和舒张压的上升。从肥大到心衰的过渡以几个细胞组织的变化为特征。例如，正常的肥大的细胞有较大的尺寸，伴有增强的且有序的收缩单位以及较强的细胞-细胞粘连。反之，病理状态的肥大的细胞，其尺寸亦较大并有蛋白聚集，表现出收缩蛋白的无序化(肌小节结构紊乱)以及较差的细胞-细胞粘附(肌纤维紊乱)。因此，在病理状态的肥大中，细胞尺寸的增加以及收缩蛋白的聚集与肌小节结构的无序组装和牢固的细胞-细胞相互作用的缺失相关联。大约有5百万美国人患有心衰，并且每年新增病人在55万以上。当前治疗心衰的药物主要集中于血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂，这些血管舒张剂引起血管扩张、降低血压并减少心脏的工作量。虽然死亡率的百分数下降是具有统计学差异的，但使用ACE抑制剂后实际的死亡率下降平均仅为3% _4%，并且还有几种潜在的副作用。ACE抑制剂也与其他药物联用，比如洋地黄，能增加心脏收缩的力量；和/或某种利尿剂，通过引起肾脏排除血液中更多的钠和水从而有助于减轻心脏的工作量。然而，至少有一项研究证明在II-III级心衰病人使用洋地黄与安慰剂相比，其生存率没有什么差异。 此外，利尿剂能改善心衰的某些症状，但不适宜用来单独治疗。预防或治疗心衰的其他选择亦有相应的局限。比如，心脏移植显然比药物治疗更昂贵及更具侵入性，并且还进一步受有无供体心脏的限制。使用机械装置，比如双心室心脏起搏器，同样是侵入性的并且较昂贵。因此，由于当前治疗手段的不足，需要有新的治疗措施。一种很有前途的新的治疗手段包括给心衰患者或有心衰风险的患者施用纽兰格林(此后称为“NRG”)。NRGs由一个结构上相关的生长和分化因子家族组成，包括NRG1、 NRG2、NRG3和NRG4及其异构体。例如，已鉴定的NRGl的异构体超过15个，可以根据它们基本的表皮生长因子(EGF)类似区的差异分成α和β两大类。NRG-I在如下文献资料中被提及，如美国专利 5，530，109，5，716，930，7，037，888 ；Lemke, Mol. Cell. Neurosci. 1996， 7 :247-262 ；Peles 禾口 Yarden，1993，BioEssays 15 :815-824,1993 ；Peles et al. ,1992, Cell 69 :205-216 ；Wen et al.，1992，Cell 69 :559-572 ；Holmes et al.，1992，Science 256 :1205-1210 ；Falls et al. , 1993, Cell 72 :801-815, Marchionni et al.,1993, Nature 362 :312_8，以上内容通过引用完整的合并于此。NRG-2在如下文献资料中提及，如 Chang et al. ,1997,Nature 387 :509-512 ；Carraway et al. ,1997,Nature 387 :512-516 ； Higashiyama et al.，1997，J.Biochem. 122 :675-680 ；Busfield et al.，1997，Mol.Cell. Biol. 17 :4007-4014和WO 97/09425，以上内容通过引用完整的合并于此。NRG-3在如下文献资料中提及，如Hijazi et al. ,1998, Int. J. Oncol. 13 :1061_1067，其内容通过引用完整的合并于此。NRG-4在如下文献资料中提及，如Harari et al.，1999，Oncogene. 18 沈81-2689，其内容通过引用完整的合并于此。NRG与Ei7G受体家族的成员结合，该受体家族包括EGFR、ErbB2、ErbB3和ErbB4， 其中每一个受体在多种细胞功能中都发挥重要的作用，包括细胞生长、分化和存活。它们都是蛋白酪氨酸激酶受体，由一个细胞外配体结合结构域、跨膜结构域和细胞质酪氨酸激酶结构域组成。NRG结合至ErbB3或ErbB4的细胞外结构域后，能够诱导构象改变从而引起 ErbB3、ErbB4和ErbB2之间形成异二聚体，或者ErbB4自身形成同源二聚体，这样就会导致受体细胞内C-末端结构域的磷酸化。然后磷酸化的细胞内结构域与细胞内其他的信号蛋白结合，活化相应的下游AKT或ERK信号传导途径，并诱导一系列的细胞反应，比如刺激或抑制细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡、细胞迁移或细胞粘附。在这些受体中，主要是ErbB2和 ErbB4在心脏表达。已有研究表明NRGl的EGF类似区，约50至64个氨基酸，足以结合并活化这些受体。以前的研究表明纽兰格林-1 β (NRG-1 β )能以高亲和力直接结合ErbB3和ErbB4。孤儿受体ErbB2能与ErbB3或ErbB4形成异源二聚体并且其亲和力比ErbB3或ErbB4同源二聚体要高。神经发育的研究结果提示交感神经系统的形成需要完整的NRG-I β、ErbB2和 ErbB3信号传导系统。靶向破坏NRG-I β、或ErbB2或ErbB4后由于心脏发育缺陷而导致胚胎致死。最近的研究也突显了 NRG-I β、ErbB2和ErbB4在心血管发育以及维持成年正常心脏功能方面具有重要作用。研究表明NRG-I β能增强成年心肌细胞的肌小节的组织结构。 短期施用一种重细的NRG-I β EGF类似区能显著改善或防止三种不同心衰动物模型的心肌功能的恶化。更重要的是，NRG-I β能显著延长心衰动物的存活。这些效应使得NRG-I β有望成为一种治疗多种普通疾病导致的心衰的广谱治疗物或先导化合物。多能干细胞(EQ可能是能分化成为有功能的心肌细胞的无限制的来源。这种由多能干细胞分化的心肌细胞能够使得ES在治疗心脏疾病方面得到应用，同样提供了重要的工具探索心肌细胞和心脏成熟的分子机制。最近的研究证明心脏祖细胞有潜能分化成为心脏的三种主要类型的细胞心肌细胞、平滑肌细胞和内皮细胞。详情可见Boheler et al. , Circ. Res. ,91 :189-201(2002) ；Kattman et al.,2006, Dev Cell,11 :723-732 ； Moretti et al. ,2006, Cell,127 :1151-1165 ；Wu et al. , Cell,127 :1137-1150 ；Garry et al.，2006，Cell, 127 :1101_1104。然而至今为止，ES细胞在体外分化成心肌细胞仍然是一个不明确的、低效且相对无选择的过程。因此，需要寻找诱导和指引ES细胞分化成为心肌细胞的组合物和方法。特别是需要发现能够在体内和体外诱导ES细胞分化为心肌细胞系的小分子物质。本发明符合了此要求和其他需求。图片简要说明

图1显示了用安慰剂和纽兰格林治疗的心脏的部分的对比图片。其中图Ia和图 Ib为安慰剂治疗的梗死心脏切片，图Ic和图Id为纽兰格林治疗的梗死心脏切片。发明概述本发明提供了纽兰格林诱导和指引ES细胞向心肌细胞系分化的应用。任何NRG(如NRG-l、NRG-2、NRG-3以及NRG-4和其异构体)蛋白、多肽或片段可用于本发明中。在某些具体实施例中，纽兰格林包含NRG-I编码的EGF样功能区。在某些实施例中，纽兰格林包含SEQ ID NO 1的氨基酸序列。本发明提供了诱导心肌生成的方法。在某些具体实施例中，哺乳动物细胞接触到纽兰格林，并因此分化成为心肌细胞系。这种接触可发生在体内或体外。鉴于纽兰格林的诱导心肌生成作用，在某些具体实施例中，它被应用于治疗心肌紊乱类疾病，如心衰、心肌病和心律不齐；也可用于修复心脏病带来的心肌组织损伤。本发明提供了治疗心肌紊乱的方法，该方法是通过将哺乳动物细胞与纽兰格林接触，因此使哺乳动物细胞分化成心肌细胞系。哺乳动物细胞也可进一步与对心肌生成有利的复合物或蛋白接触。如果哺乳动物细胞在体外与纽兰格林接触，分化的细胞能施用给患有可治疗的紊乱疾病的对象，因此得到治疗。在某些实施例中，哺乳动物细胞可依附在固体载体上(如三维的基质或平面基质)或注射到心肌受损的区域。在某些实施例中，哺乳动物细胞在体内与纽兰格林接触。如果哺乳动物细胞是在体内与纽兰格林接触，对于本领域熟练技术人员此过程包括但不局限于口服、静脉注射、皮下或腹膜内给药。哺乳动物细胞分化成心肌细胞系可用本领域公知的任何技术检测。在某些实施例中，哺乳动物细胞分化成心肌成肌细胞是通过检测心肌生成的标志基因的表达，如心房利钠因子(ANF)。在某些实施例中，哺乳动物细胞分化为心肌细胞是通过检测心肌细胞特异性转录因子的表达(如MEF2或Nkx2.5或同源转录因子HOP)。在某些实施例中，该分化是通过检测心肌细胞特异性基因的表达，如MLC-2v或eHAND ；在某些实施例中，该分化是通过检测心脏特异性基因的表达，如GATA-4;或有关心肌细胞收缩基因的表达，如肌球蛋白重链 (MHC)。在进一步的实施例中，该分化可通过应用本领域技术人员熟知的标准技术观察心肌的搏动。在某些实施例中，哺乳动物细胞是干细胞(如胚胎干细胞或胚胎癌细胞)在某些实施例中，干细胞来自于鼠(如鼠未分化的Rl胚胎干细胞或鼠癌细胞P19)或灵长类(如人类)。发明详述A.释义除另有定义，这里使用的所有技术及科技术语与本发明所属技术领域的普通技术人员理解含义相同。此处所提到的所有专利、申请、公开的申请以及其他出版物都通过引用完整的合并于此。如果本部分所提出的定义与通过引用合并于此的专利、申请、公开的申请以及其他出版物中提出的定义相反或不一致时，则以本部分提出的定义为准。
除非特别指明，在此所用“一个”的意思是“至少一个”或“一个或多于一个”。在此所用“约”或“大概”是指与给定值或范围相距20%，优的是10%，更优的是 5% (或或更少)内的。在此所用“给药”是指通过注射或其它生理途径将体外的物质送入病人体内，如通过粘膜、皮肤内、静脉、肌肉途径和/或其他在此所描述或领域内公知的任何生理途径。当用于治疗某种疾病或症状时，给药过程发生在出现疾病或症状后。当用于预防某种疾病或症状时，给药过程发生在出现疾病或症状前。此处所用的“有效剂量”是指治疗疾病时给予病人的纽兰格林或含有纽兰格林的组合物足以起到治疗该疾病的剂量。有效剂量在不同情况下不同，尤其取决于纽兰格林的类型、疾病种类和其严重程度，以及病人的年龄、体重等。在某些实施例中，有效剂量指足够能降低肺毛细血管楔压的纽兰格林剂量。此处所用“神经调节蛋白”或“neuregulin”或“NRG”是指能够结合并激活ErbB2、 ErbB3,ErbB4或其异源或同源二聚体的蛋白或多肽，包括神经调节蛋白的异构体、神经调节蛋白中的EGF样功能域、包含神经调节蛋白EGF样功能域的多肽、神经调节蛋白的突变体或衍生物以及其它能够激活上述受体的神经调节蛋白样的基因产物。优选的，神经调节蛋白是可以结合并激活ErbB2/ErbB4或ErbB2/ErbB3异源二聚体的蛋白或多肽。神经调节蛋白还包括NRG-1，NRG-2, NRG-3和NRG-4蛋白、多肽、片段以及具有NRG样功能的复合物。本发明所用神经调节蛋白可以激活上述受体并调节它们的生物学功能，比如刺激乳腺癌细胞分化和乳蛋白的分泌；诱导神经脊细胞分化为khwarm细胞；刺激骨骼肌细胞内乙酰胆碱受体的合成；以及促进心肌细胞分化、成活和DNA合成。神经调节蛋白还包括那些具有并不实质性影响生物学功能的保守性突变的神经调节蛋白突变体。本领域技术人员熟知合适的保守性替换氨基酸并且使之替换后的分子生物功能不变。本技术领域中技术人员熟知， 非关键区域的单个氨基酸的突变一般不会引起该蛋白或多肽的生物学功能的改变(参见 Watson等人,Molecular Biology of the Gene,4th Edition, 1987,The Benjamin/Cummings Pub. co. , p. 224) ο此处所用的“蛋白”与“多肽”或“肽”的含义相同，除非文中另有明确说明。此处所用的术语“个体”和“病人”可以互换。此处所用个体优选的是哺乳动物， 如非灵长类(如牛、猪、马、猫、狗、鼠等)或灵长类(如猴和人)，最优选的是人类。此处所用的“治疗”或“处理”是指可以使不适、紊乱或疾病的症状改善或向好的方向改变的任何方式。其效果可以是预防性的，比如完全或部分防止某一疾病或其症状发生，也可以是治疗性的，比如部分或完全治愈某一疾病和/或该疾病引起的不利影响。治疗还包括此处所述组合物的任何药物用途。此处所用的“活性单位”或“1U”是指能引起50%最大反应的标准产品的用量。换句话说，为了测定某一活性制剂的活性单位，必须测定EC50。例如，如果某一产品的EC50是 0.067 48/!111，则这个量就是1个单位。进一步来说，如果使用了 Iyg该产品，就是使用了 14. 93U(l/0. 067)。可以用本领域已知的任何方法来测定EC50，包括下面的实施例中发明人所使用的方法。活性单位的测定对于遗传工程产品和临床使用药物的质量控制是重要的， 这样可以使不同医药品和/或不同批次的产品以同样的标准来定量。在某些例子中，纽兰格林的单位是通过用激酶受体活化酶联免疫吸附法
6(KIRA-ELISA)测量纽兰格林的活性而确定的，如W003/099300和Sadick et al.，1996， Analytical Biochemistry, 235 :207-14中详细描述的，其内容通过引用而完整地合并于此。简言之，该方法测量了纽兰格林诱导的贴壁的乳腺癌细胞系MCF-7的ErbB2活化和磷酸化。用Triton X-100裂解液来溶解膜蛋白，其中的受体被包被在ELISA孔中的与ErbB3 或ErbB4无交叉反应的ErbB2特异性抗体(如H4)捕获。受体的磷酸化程度通过抗磷酸化酪氨酸抗体ELISA测定。此处所用的“心肌生成”是指祖细胞或前体细胞分化成心肌细胞及心脏组织的形成。祖细胞或前体细胞可以是多能干细胞，如胚胎干细胞。祖细胞或前体细胞可以是定向分化成心肌细胞系的细胞(如前心肌细胞)，也可以不是(如多潜能成体干细胞)。此处所用的“干细胞”是指任何具有自我复制能力的多潜能细胞或祖细胞或前体细胞，可以分化成多种细胞类型。适用于本发明的方法的干细胞包括能分化成心肌细胞系 (如心肌细胞)的干细胞。应用于本发明的方法的合适的干细胞包括，如胚胎干细胞(ESCs) 和胚胎癌细胞(EC)。多能胚胎干细胞能够分化成所有类型的组织，包括神经细胞、肌肉细胞、血细胞等，参见 Spradling et al.，2001，Nature 414:98-104。此处所用的“分化”是指前体细胞或祖细胞(如干细胞)分化成特殊类型的细胞如心肌细胞的过程。已分化的细胞能依靠一系列的特定细胞类型具有的独一无二的特别的特征鉴定出来。如，已分化细胞可以凭借其基因表达谱和蛋白表达谱来鉴定。典型地， 心肌细胞系的细胞表达特定基因，如肌球蛋白重链基因，肌球蛋白轻链2V、eHAND和ANF，参见 Small et al.，Cell,110 :725-735(2002) ；Shin et al.，Cell，110 :725-35(2002)。典型地，心肌细胞系也表达心肌细胞特异性转录因子如MEF2，Nkx2. 5或同源转录因子HOP。 参见 Edmondson et al. , Development,1251-1263(1994) ；Lin et al. , Science,276 1404-1407(1997)。参与心肌细胞分化的额外的转录因子还包括，如GATA4 (参见Gr印in et al. ,Development, 124 :2387-95 (1997))。本领域技术人员可知其他心肌细胞特异性基因可用来监控和决定分化过程。“心肌细胞标志基因”是仅心肌细胞生长发育时或极少数其他细胞类型表达的基因，所以该标志基因能用于鉴定某种细胞是否是心肌细胞。心肌细胞标志基因的例子，如 ANF，它是一种主要在心肌细胞内合成的多肽激素，并且是几种有关心肌生成转录因子的下游靶标。此处所用的“固相载体”与诱导心肌生成相关，是指可用于培养干细胞的三维基质或平面基质。固相载体可以是从天然存在的物质或合成的物质中获得。比如，以天然存在的物质构建的基质可能包含自体骨碎片或能买到的骨的替代品，参见Clokie et al. , J. Craniofac. Surg. 13(1) :111-21 (2002)禾口 Isaksson, Swed. Dent. J. Suppl. ,84 1-46 (1992)。合适的合成的基质可参见美国专利5，041，138，5，512，474，6，425，222，如可生物降解的人工聚合物，具体有聚乙醇酸、聚原酸酯或聚酐，可用于做固相载体。碳酸钙、霰石和多孔陶瓷(如密实骨料陶瓷)同样也适合用于固相载体。聚合物如聚丙烯、聚乙二醇和聚苯乙烯也能用于固相载体。三维基质的固相载体上培养和分化的细胞将生长覆盖基质整个表面，内部和外部。平面基质的固相载体上培养和分化的细胞生长成单层细胞。此处所用的“培养”是指在一定条件下维持细胞使其能够增殖和/或分化，并且避免衰老。举个例子，本发明中的培养的胚胎干细胞能增殖和分化成心肌细胞系。在含有合适生长因子的培养基中培养细胞，如生长因子可以是含有促进或加强心肌细胞生长的蛋白的混合物。B.纽兰格林用于诱导心肌牛成本发明提供了诱导哺乳动物细胞心肌生成的方法。在某些具体实施例中，该方法包含将哺乳动物细胞与纽兰格林接触的步骤，因此使哺乳动物细胞分化成心肌细胞系。哺乳动物细胞可在体内或体外与纽兰格林或含有纽兰格林的组合物接触。举例来说，纽兰格林可通过静脉注射或手术给药直接到达受伤或功能障碍的心肌组织。体内诱导心肌牛成纽兰格林可用于诱导体内心肌生成。给对象施用纽兰格林，该量足以诱导哺乳动物细胞分化成心肌细胞系，该对象可以哺乳动物如人。鉴于纽兰格林诱导心肌生成的能力， 它被认为对修复急性心脏病造成的心肌伤害和治疗紊乱如心肌炎有效果。在某些实施例中，为了研究心肌组织的生长成熟，纽兰格林用来促进心肌细胞生成。在某些实施例中，纽兰格林可用于治疗心肌组织受损或减弱而需修复或加强的对象。在某些实施例中，纽兰格林可用于治疗要求心肌组织加强和强化的对象，其心肌组织并未受损或弱化，这些人可能包括，比如易患心脏疾病或紊乱的高危人群。本领域技术人员可知纽兰格林可单独使用或与其他复合物和最佳用药法联用，诱导心肌生成。举例来说，纽兰格林可以与纯化的或合成的生长因子和其他药剂联用，或与能加强心肌组织生长的组合物。纽兰格林的有效剂量取决于，比如伴随给药过程的任何有害的副作用的发生、属性和范围；纽兰格林的EC50值；不同浓度纽兰格林的副作用。典型地，施用纽兰格林的量由按体重每公斤0. OOlmg到20mg不等，更典型的是每公斤0. 05mg到15mg，最典型的是每公斤 0. Olmg 至Ij IOmg0纽兰格林的给药方式有静脉注射、口服、腹膜内给药或皮下给药。静脉注射是优选的给药方式。纽兰格林的制剂可以是单剂或多剂密封包装，如安瓶和药水瓶。施用给个体或对象之前纽兰格林可以与药学上可接受的载体一同制备。药学上可接受的载体在某种程度上取决于施用何种组合物和何种给药方式。相应地本发明的药物制剂有很多合适的制备方法(参见《雷明顿制药学》，第17版，1989)。纽兰格林可制成适合其它给药途径的制剂，给药方式有静脉注射、口服、腹膜内给药或皮下给药。制剂形式包括，如水溶的和非水溶的、无菌等渗注射液，可含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂、能调节制剂使其与受试者的血压平衡的溶质、水和非水的无菌悬浮液(悬浮液中含有悬浮剂)、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。注射液和悬浮液可从无菌粉末、颗粒和药片中制备。本发明中给施用对象的剂量应足以对病人起到有益的治疗效果。举例来说，纽兰格林用于治疗或预防心肌炎时，给病人施用的剂量应足以预防、延迟、反转心肌节律性收缩能力的降低。剂量值取决于所用到的特殊制剂的效率以及需要治疗的病人的状况如体重和体表面积。剂量值也取决于制剂施用于某病人时伴随的任何不良副作用的发生、属性和范围。体外诱导心肌生成纽兰格林可用于诱导体外心肌生成。在某些实施例中，通过将哺乳动物细胞与纽
8兰格林接触，因此使哺乳动物细胞分化成心肌细胞系。用于分化成心肌细胞系的细胞可来源于任何适合的哺乳动物细胞。比如，细胞可取材于啮齿动物如小鼠、大鼠、豚鼠和兔；非啮齿类动物如狗、猫、猪、羊、马、牛和山羊；灵长类动物如黑猩猩和人类。用于分化的细胞可以是原代细胞也可以是传代细胞。如果是传代细胞，典型地是在细胞传到12代至15代之间时与纽兰格林接触。本发明的方法中用到的建立原代细胞系的技术和方法本领域技术人员公知(详见Humason，ANIMAL TISSUE TECHNIQUES,第 4 版，Ricciardelli et al.，In vitro Cell Dev. Biol. ,25 :1016(1989))与NRG接触的干细胞可以是人的干细胞如人间充质干细胞(MSC)。MSC可以从骨髓中排除其他细胞分离出多能干细胞获得，也可从其他有MSC来源处获得。骨髓细胞可从髂骨、腿节、胫骨、脊椎、肋骨或其他骨髓腔中获得。其他MSC来源处包括胚胎的卵黄囊、胎盘、脐带、胎儿和青少年的皮肤、血液、脂肪组织和肌卫星细胞。典型地，将含有MSC的组织样品中所得到的细胞在生长培养基中培养，该培养基含有特别的生长因子，可以刺激MSC 生长但不分化，而且选择性得仅让MSC贴壁生长。培养一段时间后，将与基底不粘连的物质除去，这样就可以得到扩充的MSC细胞。因此通过对粘附能力的阳性筛选，从没有表达与造血细胞或间充质细胞相关的标志的骨髓或骨膜细胞得到了同质的MSC细胞。优选地，与纽兰格林接触的哺乳动物细胞是干细胞，特别是胚胎干细胞(ESCs)。分离人和动物胚胎干细胞的方法本领域公知，参见Brook F. A.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94 :5709-12(1997) ；Grounds et al. , J. Histochem. And Cytochem. ,50 :589-610(2002)； Reubinoff，Nat. Biotech.，18 =399-404(2000)。哺乳动物的胚胎干细胞包括，如鼠Rl细胞和人胚胎干细胞。哺乳动物细胞(如ESCs)可以与单独的纽兰格林接触，也可与其它的生长因子组合，无论是在一个混合物中还是有先后顺序，或者在其它生长因子存在的情况下与纽兰格林接触。本领域技术人员可知纽兰格林和生长因子适合促进诱导某种细胞的分化所需的量。细胞培养依照该领域的常规技术。本领域技术人员运用已知的方法论可决定合适的培养方法和条件(详见 Freshney et al.，CULTURE OF ANIMAL CELLS，第 3 版，1994)。一般来说，培养细胞的环境应考虑这些因素，如细胞生长的基质、细胞密度和细胞接触、气体组成、培养基和温度。细胞培养在公认的对细胞生长最佳的条件下进行。这些条件包括，如温度大概 37°C、含5%0)2的湿润的空气。培养时间依据所要求的结果而变化范围很大。一般来说， 优选的培养时间是持续到细胞开始分裂增殖，通过3H胸苷掺入法和BrdU标记法测定可以方便快捷得测定增殖。培养皿、培养瓶或滚瓶可用于培养细胞，取决于本发明所用方法。适合培养的器皿包括，如多孔板、培养皿、组织培养管、培养瓶、滚瓶和之类的。根据细胞类型以经验判断细胞生长的最佳密度。细胞一般传12-15代，丢弃15代后的细胞。细胞一般在培养箱中培养生长，以提供适合的温度，如细胞来源动物的体温，考虑到温度的变化区域。一般来说，37°C是优选的培养细胞的温度。大部分培养箱内是接近湿润的空气环境。
重要的气体成分是氧气和二氧化碳。典型地，细胞培养使用大气中的氧压。培养容器在培养箱的气体环境中通过可渗透气体的帽口或未封闭的培养容器来交换气体。二氧化碳与培养液中的缓冲液一起能够稳定PH值，通常培养箱中浓度为1-10%。典型的优选的 CO2浓度为5%o细胞培养基可以是封装好的、粉末混合物或无菌处理过的液体。一般用的培养基的类型包括MEM-α，DME, RPMI 1640，DMEM, Iscove全培养基和McCoy培养基(参见 GibcoBRL/Life产品目录和参考指南；Sigma目录)。本发明的方法中使用到MEM-α和 DMEM。细胞培养基血清含量通常在5-20%，血清是加热的灭活血清，如人、马、小牛、胎牛血清。本发明方法中通常用10%的胎牛血清。培养基中常加入缓冲液以维持细胞ρΗ值在7. 2 至7. 4之间。培养基中的其他典型成分还包括，如抗生素、氨基酸、糖类和生长因子。C.心肌牛成的检测无论是体内或体外纽兰格林给药后，心肌生成可被一系列不同的方法检测出。这些方法包括但不局限于检测心肌特异性蛋白的表达；检测心肌细胞特异性转录因子的表达；检测心肌功能关键蛋白的表达和检测心肌细胞的搏动。分化的心肌细胞的施用分化的心肌细胞可以通过任何本领域技术人员公知的方法施用给对象。在某个实施例中，分化的心肌细胞附着在完整的固相载体(如三维基质或平面基质)上，通过如外科移植手术的方法施用给对象。另一种选择是在通过静脉注射、皮下或腹膜注射的方法给药前，用蛋白酶处理心肌细胞，使其从基质上分离下来。在某些实施例中，胚胎干细胞被提取出来之后与基质结合以便能够增殖和分化成心肌细胞系。细胞可提取自需要治疗的对象，自体细胞可避免移植产生的免疫反应；细胞也可来自其他对象，如异体细胞。两种情况下，细胞移植都可与适合的抑制免疫的治疗联合。本发明中的方法获得的分化的心肌细胞可通过任何本领域公知的方法施用给对象。适宜的施用方法有，如静脉注射、皮下注射、腹膜内注射和移植手术。心肌细胞可直接注射到心肌层或局部应用，如心脏手术时。细胞制成适合施用的制剂形式，比如水溶的和非水溶的、无菌等渗注射液，可含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂、能调节制剂使其与受试者的血压平衡的溶质、水和非水的无菌悬浮液(悬浮液中含有悬浮剂)、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。注射液和悬浮液可从无菌粉末、颗粒和药片中制备。已分化的细胞附着在完整的固相载体上如三维基质或平面基质上，以便进行移植手术。三维或平面基质可以通过手术移植到对象的适当的位置。举例来说，一名需要替换一部分心肌组织的病人可通过手术移植附着在固相载体上的已分化的细胞。在决定细胞的有效剂量时，这些细胞被施用于治疗或预防心肌细胞减少或功能障碍的症状，医生需要评估细胞毒性、移植反应、疾病程度和细胞抗体的产生。本发明中的方法所获得的分化的心肌细胞可以以能给病人提供心肌细胞的有效剂量施用，同时应考虑到不同浓度时的细胞副作用，以病人整体健康为出发点。施用过程可以是单剂也可是多剂的。P.纽兰格林任何纽兰格林(如NRG-I、NRG-2、NRG-3以及NRG-4和NRG突变体)蛋白、多肽或片段可用于本发明中。
神经调节蛋白或NRG是指能够结合并激活ErbB2、ErbB3、ErbB4或其异源或同源二聚体的蛋白或多肽，包括神经调节蛋白的异构体、神经调节蛋白中的EGF样功能域、包含神经调节蛋白EGF样功能域的多肽、神经调节蛋白的突变体或衍生物以及其它能够激活上述受体的神经调节蛋白样的基因产物。优选的，神经调节蛋白是可以结合并激活ErbB2/ErbB4 或ErbB2/ErbB3异源二聚体的蛋白或多肽。本发明所用神经调节蛋白可以激活上述受体并调节它们的生物学功能，比如刺激乳腺癌细胞分化和乳蛋白的分泌；诱导神经脊细胞分化为^Awarm细胞；刺激骨骼肌细胞内乙酰胆碱受体的合成；以及促进心肌细胞分化、成活和 DNA合成。本领域公知测定受体结合活性的试验。举例来说，能表达ErbB2和ErbB4受体的转染细胞可以用来测定。将表达受体的细胞与过量的放射性标记的纽兰格林共孵育，之后沉淀细胞并洗去多余的放射性标记的纽兰格林，再加入未标记的纽兰格林与放射性标记的纽兰格林竞争。本领域公知测定EC50值的方法。EC50值是使50%的已结合的放射性标记的配体脱离受体复合物所需的配体浓度。EC50值越高，受体亲和力越低。本发明的纽兰格林包括任何神经调节蛋白和其突变体，包括但不局限于纽兰格林-1 (NRG-I)、纽兰格林-2(NRG-2)、纽兰格林-3 (NRG-3)和纽兰格林_4(NRG_4)的所有异形体。NRG-I在如下文献资料中被提及，如美国专利5，530，109，5，716，930，7，037，888 ； Lemke, Mol.Cell. Neurosci. 1996,7 :247-262 ；Peles 禾口 Yarden，1993，BioEssays 15 815-824,1993 ；Peles et al.，1992，Cell 69 :205-216 ；Wen et al.，1992，Cell 69: 559-572 ；Holmes et al.，1992，Science 256 :1205-1210 ；Falls et al.，1993，Cell 72: 801-815，Marchionni et al.，1993，Nature 362 :312_8，以上内容通过引用完整的合并于此。NRG-2 在如下文献资料中提及，如 Chang et al. , 1997, Nature 387 :509-512 ；Carraway et al. ，1997, Nature 387 :512-516 ；Higashiyama et al,1997, J. Biochem. 122 :675-680 ； Busfield et al.，1997，Mol. Cell. Biol. 17 :4007-4014和WO 97/09425，以上内容通过引用完整的合并于此。NRG-3在如下文献资料中提及，如Hijazi et al. ,1998, Int. J. Oncol. 13 1061-1067，其内容通过引用完整的合并于此。NRG-4在如下文献资料中提及，如Harari et al.，1999，Oncogene. 18 J681-2689，其内容通过引用完整的合并于此。本发明的纽兰格林包括纽兰格林突变体或衍生物，它们含有一个或多个氨基酸替换、缺失和/或增加，这些变化不存在于天然存在的纽兰格林中。优选的，替换、删除或增加的氨基酸数目是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在某个实施例中，某衍生物在N端或C端含有一个或多个氨基酸的缺失、替换或增加。在另外的实施例中，某衍生物可在肽段任意残基有一个或多个氨基酸的缺失、替换或增加。纽兰格林突变体的例子详见W02007/062M，该内容通过引用完整的合并于此。在某些具体实施例中，氨基酸替换可是保守替换或非保守替换。氨基酸保守替换是建立在所涉及到的氨基酸的极性、电负性、溶解性、疏水性、亲水性和/或亲水脂性类似的基础上的。举例来说，非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；极性(亲水)氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；带正电(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸； 带负电(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。此外，甘氨酸和脯氨酸能影响多肽的链取向。氨基酸非保守替换意味着不同类的氨基酸替换。在某些具体实施例中，本发明所用纽兰格林是纽兰格林的突变体，该突变体具有不实质性影响生物学功能的保守氨基酸替换。本领域技术人员熟知合适的保守性替换氨基酸并且使之替换后的分子生物功能不变。本技术领域中技术人员熟知，非关键区域的单个氨基酸的突变一般不会引起该蛋白或多肽的生物学功能的改变(参见Watson等人， Molecular Biology of the Gene,4th Edition,1987, The Benjamin/Cummings Pub. co., p. 224)。 在某些具体实施例中，本发明所用纽兰格林是纽兰格林突变体或衍生物，其替换的氨基酸为非基本氨基酸或氨基酸的化学类似物。非必须氨基酸包括但不局限于氨基酸右旋异构体、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2_氨基丁酸、γ-Abu、ε-Ahx、6_氨基己酸、 Aib，2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、戊氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、胱氨酸、t_ 丁基甘氨酸、t- 丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基甘氨酸、β -丙氨酸、氟代氨基酸、 设计氨基酸比如β -甲基氨基酸、C端α -甲基氨基酸、N端α -甲基氨基酸和一般的氨基酸类似物。本发明的纽兰格林包括纽兰格林同源物，它是指氨基酸序列与纽兰格林或纽兰格林结合区域是同源的且/或结构上与纽兰格林或纽兰格林结合区域相似的多肽，以至于纽兰格林同源物能够结合并激活ErbB2/ErbB4或ErbB2/ErbB3异源二聚体蛋白激酶。典型地， 天然蛋白的同源蛋白在氨基酸序列上至少有50 %，优选地至少75%，更优选地至少80%， 85%，86%，87%，88%或89%，再优选地至少90 %，91 %，92 %，93 %，94 %，最优选地至少 95%，96%，97%，98%，99%相同。本文中表示同源性的百分比是指两个对比氨基酸序列中相同(线性氨基酸序列相同位置的氨基酸残基相同)或相似(线性氨基酸序列相同位置的氨基酸残基属于上文中所述的保守性替换)氨基酸残基的百分率，同时为了达到最大的同源性，可以在需要的情况下引入间隔。在某些实施例中，纽兰格林类似物主要是以它与野生型纽兰格林序列的同源性或相似性为特征的。序列同源性，包括相同或相似氨基酸序列的比例，是由本领域中所熟知的序列对比方法来测定的，特别是运用系统默认参数的计算机运算法或软件包。无穷多的例子运用了计算机运算法则或包含有计算机运算法则的软件包来计算序列的同源性，包括下述例子。BLAST家族程序是一个典型的用于序列比较的数学运算法则(比如 Karlin 和 Altschul，1990，Proc. Natl. Acad. ki. USA，87 :2264-2268 (在 Karlin 和 Altschul，1993，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 :5873-5877 中改良)，Altschul 等，1990， J. Mol. Biol. 215 :403-410 (描述 NBLAST 和 XBLAST)，Altschul 等，1997，Nucleic Acids Res. 25 :3389-3402(描述Gapped 81^511和？5181^510)。另外一个常用的是]\^6『8和肌116『 所发明的结合与ALIGN程序版本)的运算法则，同时也可以作为GCG序列对比软件包的一部分。还有一个常用的 FASTA 程序(Pearson W. R.和 Lipman D. J.，Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85 :2444-2448,1988)，可以作为Wisconsin序列分析软件的一部分。其它还包括 Smith和Waterman发明的BESTFIT，御用“局部同源性”的运算法则来寻找两个对比序列中最相似的区域，在两个对比序列的氨基酸长度不同时，该运算法则尤其适用；和GAP，运用 Neddlemar^nmmsch(J. Mol. Biol. 48 =443-454,1970)所发明的运算法则来寻找“最大相似度”，该运算法则在对比序列的氨基酸长度相差无几，且希望进行全长对比的情况下尤其适用。同源类似物可以是来自其它物种的直系同源物，包括来自动物、植物、酵母、细菌
12等等的直系同源物，也可以来自比如野生型蛋白的突变。举例来说，同源类似物可以通过定点突变来诱导结合蛋白质相互作用试验来验证。其它的方法比如蛋白亲和层析，亲和印迹， 体外结合试验等等，是本领域技术人员熟练掌握的。为了比较两个不同的核苷酸或多肽序列，本发明所采用的描述方法是待测序列对比于参照序列的相似百分比。当待测序列的氨基酸长度小于参照序列的90%时，采用 Myers 和 Miller 的运算法则(Bull. Math. Biol. ,51 :5-37(1989)和 Comput. Appl. Biosci.， 4(1):11-17 (1988))，具体来说是运用ALIGN程序，采用系统设定参数。当待测序列的氨基酸长度大于或等于参照序列的90%时，采用Karlin和 Altschul的结合于多种BLAST程序的运算法贝丨J (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 5873-5877)。具体来说，同源百分比可以通过“BLAST 2 kquences”工具来计算(参照 Tatusova 和 Madden，FEMS Microbiol. Lett. , 174(2) :247-250 (1999))。当比较两个成对的DNA序列的同源性时，可以使用BLASTN2. 1. 2程序并且使用系统设定参数(Match 1 ； Mismatch :_2 ；Open gap :5 penalties ；extension gap :2 penalties ；gap x_dropoff :50 ； expect 10 ；and word size :ll，with filter)。当比较两个成对的蛋白质序列的同源性时， 可以使用BLASTP 2. 1. 2程序并且使用系统设定参数(Matrix :BL0SUM62 ；gap open :11 ；gap extension :1 ；x_dropoff:15 ；expect 10. 0 ；and wordsize :3，with filter) 0本发明提供的纽兰格林还包括单独的纽兰格林EGF区域、含有纽兰格林EGF区域的多肽或类似纽兰格林的基因产物，它能模拟纽兰格林的活性并结合并激活ErbB2、 ErbB3,ErbB4或其异源或同源二聚体的多肽片段。此处所用“EGF样功能域”或“EGF-like domain”是指由neuregulin基因所编码的可以结合并激活ErbB2、ErbB3、ErbB4或其异源或同源二聚体的多肽片段，并且与下述参考文献中描述的EGF受体结合区域具有结构相似性W0 00/64400 ;Holmes 等，Science，256 1205-1210 (1992)；美国专利 5，530，109 和 5, 716, 930 ；Hijazi 等，Int. J. Oncol.，13 1061-1067 (1998) ；Chang 等，Nature，387 509-512(1997) ；Carraway φ, Nature, 387 :512-516(1997) ；Higashiyama J. Biochem.， 122 :675-680(1997)；以及 WO 97/09425。在某些实施方案中，EGF样功能域包含NRG-I的受体结合区氨基酸。在某些实施方案中，EGF样功能域是指NRG-I的第177-2 位、177-237位或177-240位氨基酸。在优选的实施例中，本发明提供的纽兰格林包含氨基酸序列如下Ser His LeuVal Lys Cys Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro Ser Arg Tyr Leu Cys Lys Cys Pro Asn Glu Phe Thr Gly Asp Arg Cys Gln Asn Tyr Val Met Ala Ser Phe Tyr Lys Ala Glu Glu Leu Tyr Gln (SEQ ID NO : 1)，即人NRG-I氨基酸序列177-237。上述氨基酸序列对应的核酸序列为 agccatcttg taaaatgtgc ggagaaggag aaaactttct gtgtgaatgg aggggagtgc ttcatggtga aagacctttc aaacccctcg agatacttgt gcaagtgccc aaatgagttt actggtgatc gctgccaaaa ctacgtaatg gcgagcttct acaaggcgga ggagctgtac cag(SEQ ID NO 2)0在某些具体实施例中，本发明提供的纽兰格林包含NRG-2编码的EGF样区域。在某些具体实施例中，本发明提供的纽兰格林包含NRG-3编码的EGF样区域。在某些具体实施例中，本发明提供的纽兰格林包含NRG-4编码的EGF样区域。在某些具体实施例中，本发明提供的纽兰格林包含氨基酸序列如下Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn GlyGly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro (SEQ ID NO :3)，美国专利 5，834，229 中有所描述。本发明所施用的纽兰格林能以本领域技术人员熟知的剂型或组合物形式存在。制备纽兰格林的典型的技术可参见，如美国专利7，226, 907和5，367,060，W094/026298和 W003/099300，其内容通过引用完整地合并于此。纽兰格林能以本领域技术人员熟知的任何技术制备、制成剂型和施用给对象。纽兰格林的制备纽兰格林的制备可以依据任何明显的相关技术。制备纽兰格林的典型的技术可参见，如美国专利7, 226，907和5，367，060，W094/026298和W003/099300，其内容通过引用完整地合并于此。在某些具体实施例中，纽兰格林是合成的，例如通过液相或固相肽合成，参见 Merrifield，1963，J.Am· Chem. Soc. 85 :2149 ；Fields et al，1990，Int J Pept Protein Res. 35 :161-214 ；Fields et al. , 1991, Pept Res. 4 :95_101，其内容通过引用完整地合并于此。纽兰格林可以用本领域已知的任何技术纯化，如高效液相层析，离子交换层析，凝胶电泳，亲和层析等。本领域技术人员熟知具体的纽兰格林的纯化条件。
实施例实施例1纽兰格林对心脏重津的作用实验方法1.大鼠冠状动脉结扎及心超检测200士20g Wistar雄性大鼠(中国科学院上海实验动物中心)腹腔注射氯胺酮 (Ketamine) 100mg/kg(药/体重)，仰卧固定于鼠板，颈部及胸部去毛后用新洁尔灭消毒。颈部正中切口，钝性分离气管，18G动静脉针留置第3-5气管软骨间，退出针芯，将塑料套管推入气管内l_2cm，固定，以备接小动物呼吸机(SAR-830/P ventilator，潮气量约lml/100g/ 次，频率60次/分钟)。胸部左前切口，钝性分离，暴露第4、5肋骨，用弯头纹式止血钳从肋间穿透胸壁并剪断第4肋，接通开启呼吸机，暴露心脏，观察肺充气及心跳情况。撕开心包，将上部脂肪垫上翻，充分暴露左心耳和肺动脉圆锥，于二者之间用6/0医用无损伤缝合线结扎冠状动脉前降支，可看到结扎后心肌局部呈现白色(约8mm X 8mm)，活动明显减弱。 缝合胸壁，堵住呼吸机回气口使肺充盈，用力挤压胸部排气后，缝合胸部肌肉和皮肤。观察呼吸情况，待自主呼吸后去除呼吸机。结扎后第14天用心脏超声仪(Philips Sonos 7500S4探头)检测大鼠心脏功能。 选用射血分数(以下简写“EF”)值在30-50%之间的大鼠随机分组(每组15只)。结果结扎后第15天称重以决定赋形剂或NRG需要的量。对照组静脉注射赋形剂(IOmM Na2HPO4-NaH2PO4,150mM NaCl, 0. 2% HAS(人血清白蛋白)，5 % 甘露醇，pH6. 0)，给药体积 0. 4ml/100g (体积/体重)，给药组静脉注射纽兰格林(1. 625 μ g/ml,即24. 26U/ml)，给药体积0. 4ml/100g (体积/体重)。两组均每天注射一次，连续给药5天，停药2天，再连续给药5天。之后用心脏超声仪(Philips Sonos 7500S4探头)检测所有大鼠的心脏功能。两天后，用3_5ml 10% KCl静脉注射处死大鼠，取出心脏冲洗然后在10%福尔马林中放置15-20分钟。给心脏称重，进一步切片(Leica，BM2135)，用苏木精和曙红染色并拍照(1.5X)。图1显示染色的心脏切片，图Ic或Id(用药组)中的心脏梗死面积明显小于图Ia或lb(对照组)。其中心脏梗死面积比(100% X梗死面积/总面积)用药组为 (12. 30士4. 6)，同样小于对照组(17. 87士4. 7)。这表明了纽兰格林能够在受损的心脏中诱
导血管再生和组织重建。本发明的范围不局限于实施例的描述。对本发明可以进行许多修改和变化，而不背离其精神和范围，这对本领域的技术人员将是显而易见的。这里所述的具体实施方案仅通过实施例加以提供，本发明仅由所附权利要求以及与之等效的全部范畴所限定。
权利要求
1.一种诱导心肌生成的方法，其中包括用纽兰格林接触一种哺乳动物细胞，该哺乳动物细胞接触纽兰格林后向心肌细胞系分化。
2.权利要求1的方法，其中纽兰格林是NRG-1，NRG-2,NRG-3或NRG-4。
3.权利要求1的方法，其中纽兰格林包括EGF样功能域。
4.权利要求1的方法，其中纽兰格林包括SEQID NO :1所示的氨基酸序列。
5.权利要求1的方法，其中纽兰格林在药学上可接受的载体中。
6.权利要求1的方法，其中哺乳动物细胞存在于哺乳动物体内。
7.权利要求6的方法，其中所述接触是指将纽兰格林通过静脉给药的方式给予该哺乳动物。
8.权利要求1的方法，还包括检测该哺乳动物细胞分化为心肌细胞系细胞的步骤。
9.权利要求8的方法，其中哺乳动物细胞到心肌细胞系的分化是通过检测心肌细胞标志基因的表达。
10.权利要求8的方法，其中哺乳动物细胞到心肌细胞系的分化是通过检测心肌细胞特异性转录因子的表达。
11.权利要求8的方法，其中哺乳动物细胞到心肌细胞系的分化是通过检测心脏特异性基因的表达。
12.权利要求1的方法，其中哺乳动物细胞是胚胎干细胞。
13.权利要求1的方法，其中哺乳动物细胞是灵长类动物胚胎干细胞。
14.权利要求1的方法，其中哺乳动物细胞是人胚胎干细胞。
15.权利要求1的方法，其中还包括使用促进心肌生成的蛋白接触该哺乳动物细胞。
16.权利要求15的方法，其中促进心肌生成的蛋白是参与心肌生成的生长因子。
17.权利要求1的方法，其中哺乳动物细胞附着在固相载体上。
18.权利要求17的方法，其中固相载体是三维基质。
19.一种治疗心肌疾病的方法，其中包括用纽兰格林接触一种哺乳动物细胞，该哺乳动物细胞接触纽兰格林后向心肌细胞系分化。
20.权利要求19的方法，其中纽兰格林是NRG-1，NRG-2,NRG-3或NRG-4。
21.权利要求19的方法，其中纽兰格林包括EGF样功能域。
22.权利要求19的方法，其中纽兰格林包括SEQID NO=I所示的氨基酸序列。
23.权利要求19的方法，其中心肌疾病与心肌受损相关。
24.权利要求23的方法，其中心肌疾病是心力衰竭。
25.权利要求19的方法，还包括将该分化的心肌细胞系细胞摄入到患有心肌疾病的个体中以治疗该疾病。
26.权利要求25的方法，其中所述摄入是指手术植入。
全文摘要
本发明提供了诱导哺乳动物细胞心肌生成的方法和组合物，特别是用胚胎干细胞体内和体外诱导心肌生成。
文档编号A61P9/04GK102231987SQ200980144922
公开日2011年11月2日 申请日期2009年11月9日 优先权日2008年11月28日
发明者周明东 申请人:上海泽生科技开发有限公司