专利名称：丹参素钠诱导心脏干细胞增殖的用途的制作方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种中药单体化合物丹参素钠的用途，特别涉及丹参素钠在促进心脏干细胞(cardiac stem cells, CSCs)体外增殖方面的用途。
背景技术：
心血管疾病是危害人类健康的头号杀手，其中因冠心病而死亡的占其死亡总数的50%左右。目前冠心病的发病率在40岁以上的人群占4%-7%，且呈上升趋势。有研究显示，心梗后有很少量心肌细胞发生分裂增生，但不能完整修复心肌组织因此心梗后心肌细胞数量减少，纤维瘫痕组织增生，心室重塑，心功能下降，最终发展为缺血性心力衰竭。目前 临床所用的治疗手段不能逆转已坏死的心肌，溶栓与冠状动脉搭桥以及植入支架等介入手段也只能恢复血流的再灌注，防止心梗部位的扩大，而异体心脏移植由于受供体来源,移植排斥反应及高昂的费用限制难以在临床广泛应用。近年来随着干细胞理论及技术的开展，己经取得了初步结果。这些重要发现为修复和重建病损心肌提供了很好的基础。但目前的难题是不能获得足够的干细胞用于临床治疗，国内外研究证实多种胚胎及成体干细胞在适当的培养环境中加入某种有效成份时可在体外诱导分化为心肌样细胞和大量扩增。丹参，味苦，性微寒，无毒，入心经。中医理论认为丹参具有活血通络、祛淤止痛、凉血消痈、清心除烦等功效。古有“一味丹参，功同四物”之说，丹参可用于月经不调、经闭痛经、瘤痛积聚、胸腹刺痛、热痹疼痛、疮疡肿痛、心烦不眠、肝脾肿大、心绞痛等。其主要成分为脂溶性成分和水溶性成分两大类。其中，水溶性成分主要为酚酸类物质，具有抗氧化、抗缺血、改善微循环等功效。药理研究及临床证实，丹参制剂如滴丸、注射液、草药对冠心病、心肌缺血，均有明显改善其心悸、胸闷、气短诸症的作用，对心脑血管系统等均有保护作用。丹参中最早发现的是丹参素，化学名为B-3，4_ 二轻苯乳酸，是各种丹酚酸的基本化学结构，为棕黄色粉末或黄色粉末。丹酚酸类化合物还包括丹酚酸A、B、C、D、E、F、G、H、I，迷迭香酸，紫草酸等。它们都具有很强的抗脂质过氧化和清除自由基作用。丹参素重要的药理作用体现在以下几方面
HOC H2C H(OH)COOH图.丹参素化学结构I.对心肌的作用丹参素具有缩小心肌梗死范围和减轻病程的作用，同时对心肌缺血再灌注损伤具有保护作用。张力等报道丹参素为超氧阴离子清除剂，从而推测其可保护心肌线粒体免受氧自由基引发的脂质过氧化物的损伤。苏晓华等研究表明，丹参素对大鼠心肌线粒体ADP/0，RCR及细胞色素氧化酶具有保护作用，提示丹参素为良好的Off清除剂，并对大鼠心肌线粒体膜具有保护作用。2.抑制血小板聚集及抗凝作用丹参素能明显抑制血小板的聚集，并明显增加血小板膜的流动性，提示其对冠心病有效。3.抗菌消炎及增强机体免疫作用丹参素阻止钙离子内流，显著抑制大鼠腹腔巨噬细胞产生前列腺素E2 (DGE2)及血栓丸B2 (TXB2)。4.抗动脉粥样硬化及降血脂作用丹参素抑制细胞内源性胆固醇的合成，还具有抗脂质蛋白氧化作用，降低血胆固醇，因此具有保护血管屏障，防止脂质沉积及动脉粥样硬化(AS)作用。5.抗血栓形成作用严常开等研究丹参素的活血化瘀作用，发现丹参素能明显抑制由ADP诱导的大鼠血小板体外聚集活性，延长电刺激大鼠颈总动脉后血栓形成时间，明显降低血瘀大鼠低、高切变率的全血黏度，血液黏度，红细胞压积等。但丹参素稳定性差，通常以其钠盐即丹参素钠存在，丹参素钠和丹参素具有相同的药理作用。
发明内容
本发明的目的是提供丹参素钠的一种用途，即在诱导体外培养心脏干细胞增殖的新用途。本发明人研究发现，丹参素钠具有诱导心脏干细胞增殖的用途，为临床治疗提供足够的干细胞。丹参素钠可为市售高纯度的丹参素钠(含量> 98. 5% )，也可按常规方法进行制备。本发明的优点是丹参素钠诱导心脏干细胞增殖，可为治疗心梗及梗死后恢复期心律失常的预防和干细胞治疗提供足够的干细胞，降低机体免疫排斥反应，降低急性心肌梗死的死亡率，疗效确切。
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。图I是丹参素钠体外培养心脏干细胞增殖MTT试验结果；图2是流式细胞仪检测结果。图2(1)为正常对照组；图2(2)为丹参素用药组
具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进一步说明。I.材料方法I. I 试药胎牛血清(FBS, Hyclone) ;EDTA(Sigma)、IMDM 培养基(Iscove, sModified Dulbecco ' s Medium, Gbico)、青 / 链霉素双抗(Penicilin/streptomycin,Gbico)、胶原酶(Collagenase, Sigma)、Mercaptoethanol (北京)。取 Collagenase O. 02g,用D-hank’ s液20mL配制成所需浓度,然后过滤灭菌备用。Febronectin、bFGF, EGF, LIF,HEPES和ITS均为BD公司产品。I. 2仪器Milipore纯水器(Academic-120型，美国Millipore公司)；电子天平(德国Sartorius)、深低温冰箱(美国Thermo Forma ;倒置相差显微镜日本Olympus ;离心机(Eppendorf);电热磁力搅拌器(德国IKA) ;96孔培养板、6孔培养板(丹麦Nunc);微量可调加样器(Eppendorf公司)，电热恒温干燥箱(SKG-0H,国产)。1.3CSCs分离培养取48h内新生SD幼鼠脱臼处死，在烧杯中用75%的酒精浸泡5min消毒后送入超净工作台，无菌取出大鼠心脏，放在冰浴中已灭菌的平皿中，眼科剪把心脏剪碎为Imm3的小块，加0. 1%的Collagenase 37°C消化15min，收集消化的细胞4°C，1200rpm离心IOmin, PBS洗涤两次，加入基础培养液(78. 3 % ^ IMDM, 20 % ^ FBS, I %的Penicilin/streptomycin 和 0. 7% 的 Mercaptoethanol),调整细胞浓度为 2 X IO5 细胞 /mL,以每孔0. 5mL加入包被的96孔无菌培养板，放入二氧化碳培养箱(37°C、5% CO2)内培养一周，加入0. 25%的trypsin,室温下放置5_7min,在显微镜下观察发现多数细胞变圆时，加入少许血清终止消化，轻轻侧立沿孔壁收集消化液到离心管，4°C 1200rpm离心lOmin，PBS 洗涤两次，加入第二阶段的培养液(DMEM和 Ham’s F12 (ratio I I)，bFGF(10ng/mL)，EGF(20ng/mL)，LIF(10ng/mL)，HEPES (5mM))重悬细胞，以0. 5mL/孔加入培养皿，传代三天后，用PBS收集上层圆形小细胞，培养至第三个96孔培养板，培养液在第二阶段培养液的基础上加入I. 25%的ITS，每隔3天换液一次。
I. 4MTT法观察细胞增殖细胞经传代2次后，2天后逐渐贴壁快速生长，此时将培养的细胞分为空白对照组(正常血清培养)和丹参素钠组，丹参素钠溶液配成相应浓度并过滤灭菌加入培养皿，分为 DNl 组(KTW/L)、DN2 组(l(T2mol/L)、DN3 组(l(T3mol/L)、DN4 组(l(T4mol/L)、DN5 组(10_5 mol/L)和DN6组(10_6mol/L)，每组8孔，加药后继续培养观察细胞生长状况，并分别于24h、48h后收集细胞，通过MTT法观察丹参素钠对CSCs的影响。I. 5流式细胞术检测按照抗体使用说明，避光加入抗体，行流式细胞仪测定c-kit7CD45_细胞的含量。I. 6统计分析实验数据用f±sd表示,采用Origin 8. 0软件进行统计学处理分析，两组间比较采用t检验、多组间比较采用单因素方差分析，当P < 0. 05时认为有统计学差异。2.结果2. I细胞生长状况及MTT结果细胞经传代培养后，逐渐贴壁，镜下观察，用丹参素钠加药血清培养的细胞生长增殖迅速，当其浓度超过10_3mol/L时，心脏干细胞增殖更显著(见图I所示)。2. 2流式细胞仪检测结果用药24h后，丹参素钠加药血清培养的细胞生长增殖迅速，当其浓度超过10_3 mol/L时，心脏干细胞增殖显著，与正常对照组相比，有显著的统计学差异(P< 0.05或P <0.01)。图2所示，图2(1)为正常对照组即空白血清对照组；图2⑵为丹参素用药组即血药浓度为10_2mol/L的结果。图中Q2象限为c-kit+/⑶45_部分，从图中可以看出两者相差非常显著。
权利要求
1.一种丹参素钠在促进心脏干细胞体外增殖方面的用途，其特征在于涉及一种单体化合物丹参素钠的用途，具体指丹参素钠在促进心脏干细胞体外增殖方面的用途。
2.根据权利要求I所述的丹参素钠在促进心脏干细胞体外增殖的用途，其特征在于丹参素钠的浓度为1X10_3 lXlO'ol/L时，其促进心脏干细胞增殖的作用显著。
全文摘要
本发明提供一种丹参素钠诱导体外培养心脏干细胞增殖的用途。研究发现，丹参素钠具有诱导体外培养心脏干细胞增殖的作用，为临床治疗提供足够的干细胞。其中丹参素钠可为市售高纯度的丹参素钠(含量＞98.5％)，也可按常规方法进行制备。其优点是丹参素钠诱导心脏干细胞增殖，可为治疗心梗及梗死后恢复期心律失常的预防和干细胞治疗提供足够的干细胞，降低机体免疫排斥反应，降低急性心肌梗死的死亡率，疗效确切。
文档编号C12N5/071GK102719392SQ20121014196
公开日2012年10月10日 申请日期2012年5月9日 优先权日2012年5月9日
发明者华菲, 吕勇刚, 孙纪元, 李岳洋, 杨倩, 王四旺, 程蕊 申请人:中国人民解放军第四军医大学