一种定向诱导间充质干细胞分化的方法
【专利摘要】本发明涉及一种定向诱导干细胞分化的方法，属于干细胞分化技术领域。将离体的诱导细胞接种于聚碳酸酯膜的下表面，将离体的干细胞接种至所述聚碳酸酯膜的上表面，然后将所述诱导细胞和所述干细胞共培养，干细胞定向分化为诱导细胞。本发明提供的定向诱导干细胞分化的方法为干细胞的培养提供了稳定的微环境，诱导细胞与干细胞距离更近，诱导效率高。
【专利说明】
一种定向诱导间充质干细胞分化的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及干细胞分化技术领域，尤其涉及一种定向诱导间充质干细胞分化的方 法。
【背景技术】
[0002] 干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞。间充质干细胞（mesenchymal stem cel 1 s，MSCs):是干细胞家族的重要成员，最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜 能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。如间 充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神 经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作 为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。间充质干细胞来源广泛，易 于分离培养，并且具有较强的分化潜能和可自体移植等优点，是被认为不久即将被引入临 床治疗的最优干细胞。
[0003] 近年来，人们利用Transwell技术，对间充质干细胞进行非直接接触式诱导分化共 培养，将间充质干细胞与目的细胞分别接种于Transwell的上室和下室中，通过目标细胞生 长以及分泌诱导因子，诱导间充质干细胞发生分化以及表型的转变，为间充质干细胞创造 适宜分化的微环境。但传统的Transwell共培养诱导间充质干细胞分化，其系统中的培养基 必须每隔数日进行换液来维持上室和下室细胞的正常生长，这样会造成间充质干细胞生长 的微环境不稳定，诱导效率低等问题。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种定向诱导间充质干细胞分化的方法。本发明提供的方 法实现了诱导细胞和干细胞距离的拉近，且微环境稳定，诱导效率高。
[0005] 本发明提供了一种定向诱导干细胞分化的方法，包括以下步骤：
[0006] 将离体的诱导细胞接种于聚碳酸酯膜的下表面，将离体的干细胞接种至所述聚碳 酸酯膜的上表面，然后将所述诱导细胞和所述干细胞共培养，干细胞定向分化为诱导细胞。
[0007] 优选的是，所述聚碳酸酯膜的孔径为0 · 2μπι-2 · Ομπι，更优选为1 · Ομπι。所述聚碳酸脂 膜的厚度为8~15μπι，更优选为ΙΟμπι。所述聚碳酸脂膜为圆形，直径为20~30mm，更优选为 24mm 〇
[0008] 优选的是，所述干细胞和所述诱导细胞的直径大于聚碳酸酯膜的孔径。
[0009] 优选的是，所述诱导细胞为诱导干细胞定向分化的目标细胞。
[0010] 优选的是，所述干细胞为间充质干细胞。
[0011] 优选的是，所述共培养前，所述离体的诱导细胞先进行4~8h的培养，更优选为6h。
[0012] 优选的是，所述共培养的培养时间为8~12天，更优选为10天。
[0013]优选的是，所述共培养过程中，每隔1~3天，更优选为2天更换细胞培养液。
[0014]优选的是，所述干细胞的培养基为含青霉素、链霉素和两性霉素 B的DMEM培养基； 所述诱导细胞的培养基为含青霉素、链霉素和两性霉素 B的Eplife基础培养基。
[0015] 优选的是，所述共培养具体为:接种有干细胞和诱导细胞的聚碳酸酯膜放置于细 胞培养板的培养孔上的Transwell小室中进行培养。
[0016] 本发明提供的定向诱导干细胞分化的方法，将离体的诱导细胞接种于聚碳酸酯膜 的下表面，将离体的干细胞接种至所述聚碳酸酯膜的上表面，然后将所述诱导细胞和所述 干细胞共培养，干细胞定向分化为诱导细胞。本发明对传统的Transwel 1技术进行了改进， 将离体的诱导细胞和离体的干细胞分别接种于聚碳酸酯膜的下表面和上表面，拉近了诱导 细胞和干细胞的距离，大大提升了诱导效率，且提供的微环境十分稳定。
【附图说明】
[0017] 图1是本发明比较例1提供的传统Transwell小室非接触式共培养流程示意图
[0018] 图2是本发明比较例1提供的扫描电镜下脐带间充质干细胞在不同孔径聚碳酸酯 膜的生长、迀移情况；
[0019] 图3是实施例1中Transwell小室底部聚碳酸酯膜上下表面共培养流程示意图；
[0020] 图4A是实施例1中第一组的1500倍放大的聚碳酸酯膜的膜断面电镜扫描结果；
[0021] 图4B是实施例1中第一组的5000倍放大的聚碳酸酯膜的膜断面电镜扫描结果；
[0022] 图5A是实施例1中第一组聚碳酸酯膜上表面获得的细胞在新培养皿培养十天后相 差显微镜观察结果；
[0023]图5B是实施例1中第三组聚碳酸酯膜上表面获得的细胞在新培养皿培养十天后相 差显微镜观察结果；
[0024]图6是实施例1中第一组和第三组培养的脐带间充质干细胞的荧光检测结果;其中 八-1、8-1和(：-1分别为第一组对应的？63、〇(19和01-丨1^68411的荧光检测结果4-2、8-2和(：-2分别为第三组对应的P63、CK19和β?-integrin的荧光检测结果；
[0025]图7是实施例1中第一组和第三组培养的脐带间充质干细胞中P63、CK19和β?-integrin的Western blot检测结果；
[0026] 图8是实施例1中第一组和第三组培养的脐带间充质干细胞中P63、CK19和β?-integrin基因的Real-time PCR检测；
[0027] 图9是实施例1中第一组和第三组培养的脐带间充质干细胞中CK19阳性率流式细 胞术检测结果。
【具体实施方式】
[0028] 本发明提供了一种定向诱导干细胞分化的方法，包括以下步骤：
[0029] 将离体的诱导细胞接种于聚碳酸酯膜的下表面，将离体的干细胞接种至所述聚碳 酸酯膜的上表面，然后将所述诱导细胞和所述干细胞共培养，干细胞定向分化为诱导细胞。
[0030] 本发明将离体的诱导细胞接种于聚碳酸酯膜的下表面。在本发明中，所述聚碳酸 酯膜的孔径为〇 · 2μπι-2 · Ομπι，更优选为0 · 4μπι;所述聚碳酸脂膜的厚度为8~15μπι，更优选为 10Μ1;所述聚碳酸脂膜优选为圆形，直径为20~30mm，更优选为24mm。在本发明中，所述诱导 细胞为诱导干细胞定向分化的目标细胞。在本发明中，所述诱导细胞优选为表皮干细胞，所 述表皮干细胞的主要标志物为W整合素(W-integrin)、角蛋白19(CK19)和P63。
[0031] 在本发明中，离体的诱导细胞优选为表皮干细胞，是从健康成年男性环切术后获 得皮片中分离、培养获得的。
[0032] 本发明将离体的干细胞接种至所述聚碳酸酯膜的上表面。在本发明中，所述干细 胞和所述诱导细胞的直径大于聚碳酸酯膜的孔径。在本发明中，所述干细胞为间充质干细 胞，优选为脐带间充质干细胞。
[0033] 在本发明中，离体的干细胞优选为脐带间充质干细胞，是从健康产妇分娩后获得 脐带组织中分离、培养获得的。
[0034]接种后，本发明将所述诱导细胞和所述干细胞共培养，干细胞定向分化为诱导细 胞。
[0035]本发明在所述共培养前，优选将所述离体的诱导细胞先进行4~8h的培养，更优选 为6h。
[0036] 在本发明中，所述共培养的培养时间为8~12天，更优选为10天。本发明在所述共 培养的过程中，优选每隔1~3天更换细胞培养液，更优选为2天。在本发明中，优选将聚碳酸 脂膜置于Transwell小室底部对细胞进行共培养，所述Transwell小室优选放于细胞培养板 上，更优选的是，本发明在Transwell小室底部的聚碳酸脂膜上进行上下表面的共培养。在 本发明中，用新鲜的间充质干细胞培养基更换Transwell小室中的培养基，用新鲜的诱导细 胞培养基更换培养孔中的培养基。
[0037] 在本发明中，所述间充质干细胞培养基为含青霉素、链霉素和两性霉素 B的DMEM培 养基;在本发明中，所述诱导细胞培养基优选为含青霉素、链霉素和两性霉素 B的Eplife培 养基。
[0038]在本发明中，所述共培养具体为接种有干细胞和诱导细胞的聚碳酸酯膜放置于细 胞培养板的培养孔上的Transwell小室中进行培养。更具体为:取Transwell小室倒扣，将诱 导细胞悬液滴于聚碳酸酯膜的下表面，盖好培养皿盖后置于5 % C02培养箱，37 °C温度下静 置培养6~8h;然后将Transwel 1小室放置于细胞培养板上，在Transwel 1小室的聚碳酸酯膜 上表面接种间充质干细胞，在37 °C、5 % C02培养箱内共培养8~10d。
[0039] 本发明中，所述诱导细胞悬液浓度为1.5 X 105~2.5 X 105个细胞/mL，滴加量为0.7 ~0.85ml，避免液体流下，依靠液体表面张力铺满整个聚碳酸酯膜背面而不致流散;所述间 充质干细胞悬液浓度为〇. 5 X 105~1.5 X 105个细胞/mL，滴加量为0.8~1.2ml。
[0040] 本发明应用SPSS 13.0统计分析软件进行统计学分析，数据以表示;采用单因 素方差分析比较，以P〈〇.01为统计学差异有显著意义。
[0041]下面结合实施例，对本发明提供的定向诱导干细胞分化的方法进行详细的描述， 但是不能将它们理解为对本申请保护范围的限定。
[0042] 比较例1
[0043] 脐带间充质干细胞在不同孔径聚碳酸酯膜的生长及迀移
[0044] 一、分组处理
[0045] 1、将脐带间充质干细胞处理3h，用间充质干细胞培养基洗涤细胞并悬浮细胞。
[0046] 2、分组处理：
[0047] 第一组:将6个Transwel 1小室(聚碳酸酯膜的直径为24mm、孔径为0 · 4μηι、厚度为10 Mi)放置于6孔细胞培养板上；
[0048] 第二组:将6个Transwel 1小室(聚碳酸酯膜的直径为24mm、孔径为3. ΟμL?、厚度为10 Mi)放置于6孔细胞培养板上；
[0049] 第三组:将6个Transwell小室(聚碳酸酯膜的直径为24mm、孔径为8. Ομπι、厚度为10 Ml)放置于6孔细胞培养板上。
[0050] 3、采用传统Transwell小室培养方法，传统Transwell小室非接触式共培养流程图 见图1，将步骤1得到的脐带间充质干细胞接种于步骤2得到的细胞培养板上的Transwell小 室中，每个小室接种1.5 X 105个细胞，细胞贴壁后，在Transwel 1小室中加入间充质干细胞 培养基，在Transwel 1小室下的培养孔中加入间充质干细胞培养基，在37 °C、5 %C02培养箱 内培养7天，每天将Transwe 11小室和培养孔中的培养基更换为新鲜培养基。
[0051] 二、统计细胞迀移率
[0052]完成步骤1后在相差显微镜下观察、计数迀移至膜底面的细胞数，高倍镜（X400) 下视野直径为560μπι，随机选取6个视野计数。重复实验3次，计算每个视野下平均细胞数。根 据视野面积与聚碳酸酯膜面积的比率，计算不同孔径聚碳酸酯膜背面(朝向培养孔的面)上 脐带间充质干细胞的总数，并根据计算迀移率。
[0054] 第一组(0.4μπι组）的细胞迀移率为0 %。第二组(3. Ομπι组）的细胞迀移率为1.8 %。 第三组(8 · Ομπι)组的细胞迀移率为8 · 0 %。3 · Ομπι组和8 · Ομπι组脐带间充质干细胞迀移率与 0.4μπι组相比，差异均有统计学意义(均Ρ〈0.01)。
[0055]三、扫描电镜观察
[0056]完成步骤1后，取聚碳酸酯膜，用4°C预冷3%戊二醛固定12小时，然后用PBS缓冲液 浸洗，然后用4°C预冷的1 %锇酸固定lh，然后依次用体积分数为0.70、0.85、0.95、1.00的乙 醇梯度脱水，每次15min，临界点干燥，将聚碳酸酯膜的正面(朝向Transwell小室的面）、背 面(朝向培养孔的面）以及断面分别粘台后行真空纯金镀膜，在HITACHI S-3400N型扫描电 镜下观察脐带间充质干细胞在其上生长的情况，拍摄图像。
[0057]扫描电镜下脐带间充质干细胞在不同孔径聚碳酸酯膜的生长、迀移情况（X 1500) 见图2。图2中：A-1为0.4μηι孔径组正面，A-2为0.4μηι孔径组背面，A-3为0.4μηι孔径组断面，可 以观察到〇.4μπι孔径组正面有较多的脐带间充质干细胞贴壁生长，背面未发现明显的贴壁 细胞，断面可见脐带间充质干细胞向微孔变形探入;Β-1为3.0μπι孔径组正面，Β-2为3.0μπι孔 径组背面，Β-3为3.Ομπι孔径组断面，可以观察到3.Ομπι孔径组背面出现贴壁生长的脐带间充 质干细胞，断面可见微孔孔径明显增大，脐带间充质干细胞向微孔变形探入程度增加;C-1 为8. Ομπι孔径组正面，C-2为8. Ομπι孔径组背面，C-3为8. Ομπι孔径组断面，可以观察到8. Ομπι孔 径组正面贴壁生长的脐带间充质干细胞多有部分探入微孔，背面微孔可见较多细胞探出生 长或对侧细胞伪足，断面可见微孔孔径明显增大，脐带间充质干细胞向微孔探入生长。 [0058] 结果表明：0.4μπι孔径组聚碳酸酯膜正面细胞贴壁生长，底面未见有细胞出现，断 面可见微孔狭小，无明显细胞穿越;与〇 . 4μπι组相比，3 . Ομπι组和8. Ομπι组聚碳酸酯膜孔径明 显增大，底面均有脐带间充质干细胞迀移生长，8 . Ομπι组细胞部分探出微孔生长较为明显， 两种膜断面微孔粗大，均可发现细胞变形探入孔内，细胞穿越迀移机会增大，与相差显微镜 下观察计算的迀移率趋势相一致。
[0059] 结果表明：0.4μπι孔径聚碳酸酯膜能够有效地阻止细胞的穿越和迀移，在0.4μπι聚 碳酸酯膜的双侧接种不同细胞的进行近距离非直接接触式共培养可以显著地拉近两种细 胞的距离，局部可溶性细胞因子浓度显著增高，得到接近于直接接触式共培养的效果，能够 提高共培养诱导间充质干细胞分化的效率。
[0060] 实施例1
[0061 ]新型Transwell共培养诱导脐带间充质干细胞向表皮样细胞分化 [0062] 一、分组处理
[0063] 1、将人表皮干细胞用表皮干细胞培养基处理3h，再用表皮干细胞培养基洗涤细胞 并悬浮细胞。
[0064] 2、将人脐带间充质干细胞间充质干细胞培养基处理3h，再用间充质干细胞培养基 洗涤细胞并悬浮细胞。
[0065] 3、分组处理
[0066] 第一组
[0067] Transwell小室底部聚碳酸酯膜上下表面共培养，流程示意图见图3。
[0068] 无菌条件下，取6个Transwell小室(底部的聚碳酸酯膜的直径为24mm、孔径为0.4μ m、厚度为ΙΟμπι)，倒扣于盛有少量生理盐水的无菌15cm培养皿中，将步骤1得到的人表皮干 细胞悬液逐滴滴于聚碳酸酯膜的下表面(每个聚碳酸酯膜滴加〇.75mL浓度为2 X105个细 胞/mL的细胞悬液），避免液体流下，依靠液体表面张力铺满整个聚碳酸酯膜背面而不致流 散。盖好皿盖后置于5%⑶ 2培养箱37°C条件下静置6h(此时在显微镜下观察可见ESCs贴壁 展开），然后将Transwell小室放置于6孔细胞培养板上，每个Transwell小室的聚碳酸酯膜 上表面接种1 X 1〇5个脐带间充质干细胞(步骤2得到的细胞悬液），在37°C、5%C02培养箱内 培养10天(每两天用新鲜的间充质干细胞培养基更换Transwell小室中的培养基，每2天用 新鲜的表皮干细胞培养基更换培养孔中的培养基）。
[0069]第二组
[0070] 传统Transwell小室非接触式共培养。
[0071]无菌条件下，取6孔细胞培养板，将步骤1得到的人表皮干细胞悬液接种于培养孔 底部(每个孔接种〇. 75mL浓度为2 X 105个细胞/mL的细胞悬液），细胞贴壁展开后，在细胞培 养板上放置6个Transwell小室(底部的聚碳酸酯膜的直径为24mm、孔径为0.4μηι、厚度为10μ m)，向每个Transwell小室的聚碳酸酯膜上表面接种1 X 105个脐带间充质干细胞(步骤2得 到的细胞悬液），在37°C、5%C02培养箱内培养10天(每两天用新鲜的间充质干细胞培养基 更换Transwell小室中的培养基，每2天用新鲜的表皮干细胞培养基更换培养孔中的培养 基)。
[0072]第三组：无菌条件下，在6孔细胞培养板上放置6个Transwell小室，只向每个 Transwell小室(底部的聚碳酸酯膜的直径为24mm、孔径为0.4μηι、厚度为ΙΟμπι)的聚碳酸酯 膜上表面接种1 X 1〇5个脐带间充质干细胞(步骤2得到的细胞悬液），在37°C、5%C02培养箱 内培养10天(每两天用新鲜的间充质干细胞培养基更换Transwell小室中的培养基，每2天 用新鲜的表皮干细胞培养基更换培养孔中的培养基）。
[0073]二、扫描电镜观察
[0074]将第一组处理中的聚碳酸酯膜的膜断面进行扫描电镜观察，结果见图4。图4中，A 为1500倍放大，B为5000倍放大。由图可知，部分脐带间充质干细胞向膜微孔内轻度变形探 入，两种细胞间的距离进一步拉近，未观察到细胞有迀移穿越的情况，从而表明两种细胞的 距离减小到尽可能小，但细胞却没有混杂。
[0075]三、采用相差显微镜观察
[0076]步骤一结束后，消化并收集聚碳酸酯膜上表面的细胞，接种于新的培养皿培养10 天后通过相差显微镜观察，照片见图5。图5中，A为第一组，B为第三组。采用聚碳酸酯膜双面 非直接接触的共培养l〇d后，脐带间充质干细胞细胞外形呈现扁圆的多角形，杂乱生长;而 未经诱导的细胞外观仍为梭形或长多角形，呈漩涡状生长。
[0077]四、免疫荧光检测
[0078] 步骤一结束后，消化并收集聚碳酸酯膜上表面的细胞，进行细胞爬片;在5%0)2培 养箱37°C条件下培养48h后取出细胞爬片，用PBS缓冲液冲洗2次；用4%多聚甲醛固定 lOmin，晾干，用PBS缓冲液漂洗3次（每次5min);用0.3 % Triton X-100破膜20min，用PBS缓 冲液漂洗3次(每次5min);用非免疫血清室温封闭lOmin，滴加特异性一抗(针对CK19的一 抗、针对P63的一抗或针对β?-integrin的一抗），37°C孵育60min，用roS缓冲液漂洗3次(每 次5min);滴加荧光素标记的二抗(FITC标记抗体，稀释度1:100)，37°C避光孵育30min，用 PBS缓冲液漂洗3次(每次5min);DAPI溶液复染细胞核15min，用PBS缓冲液漂洗3次(每次 5min);用抗荧光淬灭剂封片后荧光显微镜下观察细胞表达早期表皮细胞标志物的情况并 照相，采用Image-Pro Plus v6.0软件分析并Merge图像。
[0079] 照片（X100)见图6J代表P63，B代表CK19，C代表β?-integrin。采用聚碳酸酯膜双 面非直接接触的共培养l〇d后（即第一组），细胞三种抗体均呈现绿色荧光表达（图6A-UB-1 和C-1)，表明经过诱导后细胞出现了早期表皮细胞的表型。未诱导组（即第三组）的CK19和 P63未显色，呈阴性表达(图6A-2、B-2和C-2)。
[0080] 五、Western Blot检测
[0081] 步骤一结束后，消化并收集聚碳酸酯膜上表面的细胞，采用RIPA法裂解细胞，收集 总蛋白。将总蛋白进行Western Blot检测，分别采用针对CK19的一抗、针对P63的一抗或针 对β?-integr in的一抗。采用GAPDH蛋白作为内参蛋白。
[0082] Western Blot图谱见图7。采用聚碳酸酯膜双面非直接接触的共培养10d后（即第 一组），细胞中P63和CK19呈现阳性。未诱导组（即第三组）的P63和CK19为阴性。
[0083] 六、实时定量PCR检测
[0084]步骤一结束后，消化并收集聚碳酸酯膜正面的细胞，提取总RNA并反转录为cDNA， 以cDNA为模板，分别实时定量PCR检测P63基因、CK19基因和β?-integrin基因的表达量。将 actin基因作为内参基因。
[0085] 用于鉴定actin基因的引物对如下（靶序列约205bp):
[0086] F:5，-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3，；
[0087] R：5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'〇
[0088] 用于鉴定CK19基因的引物对如下(靶序列约150bp):
[0089] F:5，-TGAAAGCTGCCTTGGAAGACA-3，；
[0090] R:5，-GCCGCTGGTACTCCTGATTCT-3，。
[0091]用于鉴定P63基因的引物对如下(靶序列约174bp):
[0092] F:5，-CCTCGTCCACCAGTCCCTATAAC-3，；
[0093] R:5 '-TGCTCGACTGCTGGAAGGA-3 '。
[0094] 用于鉴定β?-integrin基因的引物对如下（革El序列约170bp):
[0095] F:5，-AGTGCTCCCACTTCAATCTCACCA-3，；
[0096] R:5，-TCTCCTTGCAATGGGTCACAGGAT-3，。
[0097] 数据分析软件为7500Fast System SDS SoftwareamRNA表达的相对量数据以RQ值 表示，其计算方式如下：
[0098] RQ值= 2(_ddCt)。
[0099] 以Actin做为内参，设置第三组目的基因的表达量为1，以倍比关系分析第一组和 第二组目的基因的相对表达量。
[0100]结果见图8。与未诱导组（即第三组)相比，采用聚碳酸酯膜双面非直接接触的共培 养10d后（即第一组），细胞中P63和CK19两种基因的表达水平显著升高（ρ〈0.01)，β lintegrin基因表达水平没有明显变化，正常脐带间充质干细胞即有β?-integrin基因表 达，因此诱导后β?-integrin基因仍然表达。
[0101]七、流式细胞术检测
[0102] 以CK19为参考标志物，应用流式细胞术对比分析第一组(改进后的Transwell共培 养方法)与第二组(传统Transwe 11共培养方法)相比诱导效率的差别。步骤如下：
[0103] 1、步骤一结束后，消化并收集聚碳酸酯膜正面的细胞，用间充质干细胞培养基制 成细胞浓度为1 X l〇6/ml的细胞悬液。
[0104] 2、取细胞悬液，加入山羊血清反应lOmin，阻断非特异抗体结合位点。
[0105] 3、加入针对CK19的一抗，作用lh。
[0106] 4、用PBS缓冲液充分洗去未结合的一抗。
[0107] 5、加入荧光素标记的二抗，避光反应30min。
[0108] 6、用PBS缓冲液充分洗去未结合的二抗。
[0109] 7、用1 %多聚甲醛固定后上流式细胞仪检测。
[0110] 结果见图9A，阳性率(CK19阳性细胞占计数细胞的比例）统计结果见图9B。由图可 知，与传统诱导对照组（即第二组）的11.4%相比，脐带间充质干细胞经新型共培养10d后 (即第一组），细胞中CK19表达阳性率显著升高，达到54.3% (p〈0.01)，新型共培养有更高的 诱导效率。
[0111]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种定向诱导干细胞分化的方法，包括以下步骤： 将离体的诱导细胞接种于聚碳酸酯膜的下表面，将离体的干细胞接种至所述聚碳酸酯 膜的上表面，然后将所述诱导细胞和所述干细胞共培养，干细胞定向分化为诱导细胞。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚碳酸酯膜的孔径为0.2μπι-2. Ομπι，所 述聚碳酸脂膜的厚度为8~15μηι。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述干细胞和所述诱导细胞的直径大于聚 碳酸酯膜的孔径。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱导细胞为诱导干细胞定向分化的目 标细胞。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述干细胞为间充质干细胞。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述共培养前，所述离体的诱导细胞先进 行4~8h的培养。7. 根据权利要求1或6所述的方法，其特征在于，所述共培养的培养时间为8~12天。8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述共培养过程中，每隔1~3天更换细胞 培养液。9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述所述干细胞的培养基为含青霉素、链 霉素和两性霉素 B的DMEM培养基;所述诱导细胞的培养基为含青霉素、链霉素和两性霉素 B 的Eplife基础培养基。10. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述共培养具体为:接种有干细胞和诱导 细胞的聚碳酸酯膜放置于细胞培养板的培养孔上的Transwell小室中进行培养。
【文档编号】C12N5/074GK105950549SQ201610392893
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年6月6日
【发明人】李东杰, 柴家科, 申传安, 孙天骏
【申请人】李东杰