多能干细胞向多能肾前体分化的方法
【专利说明】多能干细胞向多能肾前体分化的方法 发明领域
[0001] 本申请设及多能干细胞（PSC)向表达Six2的确定的多能肾前体细胞分化的方 法。运些肾前体细胞能够分化成完全功能性的和完全分化的足细胞。此外，本申请设及基 于化学成分确定的培养基诱导的连接步骤，使人胚胎干细胞巧SC)和经诱导的多能干细胞 (iPSCs)分化成表达Six2的确定的肾前体细胞和足细胞的方法。 柳0引背景
[0003] 肾细胞用于基础研究、疾病模型、组织工程、药物筛选和体外毒理学。肾具有高度 分化和复杂的结构，并且在许多生理过程中具有关键作用，所述生理过程为诸如体液重量 摩尔渗透压浓度、流体和电解质平衡的调节、酸碱平衡的调节、代谢废物和外来化学物的排 泄，和控制血压的激素的产生和红细胞生成。一旦受损，肾脏很少恢复其功能。肾细胞（例 如，足细胞和肾小管细胞）在急性坏死后可W在一定程度上再生。然而，肾脏在具有慢性肾 病的患者中一般不再生（Hump虹巧shBonventre，2007)，导致末期肾功能不全。慢性肾病 (CKD)是发病和死亡的主要原因，在西方国家影响11%的成年人口。患有CKD的人遭受生 命质量的显著下降。该疾病引起的药物经济负担是非常高的，因为用于移植的供体肾脏存 在持久短缺。
[0004] 哺乳动物肾脏来自间介中胚层（IM)，间介中胚层产生输尿管（ND)，和后肾间充质 (MM)。ND产生集尿管系统，其由两个关键细胞类型：主细胞和罔细胞组成。MM限定了帽间 充质（CM)并且也产生了间质。CM是肾单位祖先群体并且在肾泡中通过间充质向上皮的转 变分化。 阳0化]肾单位由肾小球簇或血管小球，和肾小管组成。血管小球是高度特化的过滤单位， 其为分离废物作为尿排泄。血管小球中血液和尿之间的过滤屏障由高度特化的，称作足细 胞的终末分化细胞提供。
[0006] 会聚的证据提示足细胞的损伤是引发肾功能损失的关键事件之一。足细胞损伤在 超高膜岛素血症、血液动力学机制和其他机制之后发生。足细胞的渐进性损失导致肾小球 的广泛硬化，伴随着增加的蛋白尿和清除功能的减弱（Wiggins, 2007)。
[0007] 然而，还没有完全理解导致肾脏肾单位中病理生理改变的膜岛素抗药性和再生性 质丧失的潜在机理。从而，需要体外细胞模型来研究肾病像CKD的生物学和促进开发新的 治疗。
[0008] 胚胎干巧巧细胞和患者特异性诱导的多能干细胞（iPSCs)是大规模生产肾前 体细胞和足细胞的潜在来源，所述细胞用于再生性药物和疾病建模用于药物发现。使 用经诱导的多能干细胞（iPSCs)技术（Tak址ashi,K. &Yamanaka,S. ,"Inductionof pluripotentstemcellsfrommouseembryonicandadultfibroblastcultures bydefinedfactors"，Cell126, 663 - 676 (2006))，可W通过转导四种确定的因子 (Sox2, 0ct4,Klf4,c-20Myc)，将体细胞再编程为iPSCs。iPSC技术使得能够产生患者特异 性iPSCs，其可W分化为患者特异性肾细胞。运些患者特异性肾细胞可用于例如肾病如慢 性肾病（CKD)、局灶性节段性肾小球硬化症（FSG巧、膜性增生性肾小球肾炎、多囊性肾病 (PKD)和与2型糖尿病相关的糖尿病肾病的病理生理学的体外建模或用于评估药物毒性。 尝试运种体外疾病建模的一个重要的前提是实现有效的、稳健的和大小可变的分化系统 (Tiscornia等人，2011)。
[0009] W前的将人PSC分化成肾细胞的努力没有实现在人类度atchelder等人，2009 ; Lin等人，2010;Mae等人，2013;Narayanan等人，2013;Song等人，2012)或小鼠化im andDressier, 2005;Mae等人，2010 ;Mo;rizane等人，2009 ;Nish;Lkawa等人，2012;Ren等 人，2010)中与药物发现运动或再生细胞疗法相关的规模和功效。此外，主要的担屯、是细胞 错误分化成不想要的组织或甚至形成崎胎瘤。为了避免该危险，必须将细胞导向一种分化 状态，其一方面为它们提供再生成熟的目的肾细胞的潜力并且另一方面防止错误分化。运 可W通过肾转录因子的正确网络的受控活化实现。不幸的是，已经证明在体外获得该精确 的分化状态是十分困难的。已经应用生长因子组合[骨形态发生蛋白度MP)/激活蛋白/ 视黄酸]和遗传方法，进行了许多尝试来W运种方式诱导多能细胞。然而，多数分化研究， 甚至在成功诱导肾谱系基因后，都不能在肾发生中精确地找到该确切状态（IM，MM，CM)，其 中ESC沿着肾谱系分化成该状态。
[0010] 因此，仍待开发用于刺激人多能干细胞分化成肾谱系的高度有效和化学上确定的 方法。
[0011] Mae等人2013描述了使用确定的诱导步骤，在无血清的培养基中使人多能干细胞 分化成表达Osrl的间介中胚层细胞的方案。作者用Accutase解离了未分化的细胞W得到 单层细胞并用在第一步中用激活蛋白A、GSK3 0抑制剂和ROCK激酶抑制剂并且在第二步中 用GSK3β抑制剂诱导分化。作者在第11天仅获得了 90%Osrl阳性细胞。在18天后观察 到PAX2,LIM1，WT1，CITED2,EYA1和SA化1 (正发育肾、性腺和肾上腺皮质的标记基因）的表 达，表明作者获得了不同细胞类型和不同分化状态细胞的异质细胞群体。
[0012] Lin等人，2010描述了通过降低血清浓度和饲养层密度14天，人胚胎干细胞分化 成中胚层肾祖细胞谱系。作者获得了分化的人胚胎细胞的异质性群体，通过流式细胞术将 它们分级分离。
[0013] Batchelder等人，2009描述了通过W单层在层粘连蛋白或明胶基质上用视黄酸、 激活蛋白A、BMP7或BMP4培养胚胎干细胞，使胚胎干细胞向肾谱系直接分化。他们在第4 天获得了具有被上调的间介中胚层标记基因（PAX2，SIX2，WT1和0SR1)的细胞。然而，肾前 体的标记物和未分化细胞的标记物也在第4天升高。Batchelder等人没有表明该异质性群 体进一步分化成确定的细胞类型。通过具有胚状体的阶段实现了胚胎干细胞的分化，该阶 段一般限制了该方案的再现性和标准化。
[0014] 因此，用于人胚胎干细胞分化成肾前体的现有技术方案具有主要的缺陷：首先，多 数方案导致异质性细胞群体并且稳定表达后肾间充质标记物的确定肾前体细胞的绝对产 率是非常低的。此外，通过多数已知的方法使多能干细胞分化成肾前体细胞的总体时间是 非常长的。许多方案需要不确定的要素，如用原代细胞分泌的因子调节的培养基、与饲养层 共培养，其限制了运些方案的标准化。此外，许多方案依赖于细胞聚集物或胚状体，其由于 它们的异质性性质而限制了运些技术的再现性。
[0015] Song等人2012是首次报道的将人诱导的多能干细胞分化成肾足细胞的方案。在 补充胎牛血清和不同的生长因子度MP7、激活蛋白A和视黄酸）的培养基中10天的定向分 化后，作者获得了具有足细胞表型的iPS细胞。他们获得了表达足细胞特异性基因但是仍 然表达后肾间质基因PAX2和WT1的细胞，表明所获得的足细胞是不成熟的和不完全分化 的。Song等人没有描述任何分化的中间阶段，像间介中胚层或后肾间充质。
[0016] 已知的方案均提供了确定的肾前体细胞，其表达Six2，WTl，和SA化LPAX2的表达 被下调，即，确定的后肾间充质细胞。已知的方案均没有描述肾前体细胞向足细胞的分化。
[0017] 总之，没有一种方法提供在仅仅六天后W非常高产率表达后肾间充质标记物的肾 前体细胞的确定群体。此外，已知的方案均没有提供仅在13天后非常高产率的完全功能和 完全分化的足细胞。
[0018] 本发明提供了与现有技术方案相比，W更短的时间量化天）和显著增加的产率 (高达95%产率的表达标记基因SIX2,SALL1和WT1的肾前体细胞）使多能干细胞分化成 确定的后肾间充质肾前体阶段的改进方法。该新方法减少了从多能干细胞获得胚状体或小 细胞团的必要性并且去除了迄今已知的方法的低再现性和标准化的主要缺陷。此外，高效 率允许在药物发现和安全性评估中、在再生性药物应用中和在制药工业中体外疾病建模中 W大规模使用运些确定的前体细胞。此外，该新方法允许选择性调节后肾间充质肾前体细 胞，其使得能够在13天后将谱系定型转变成完全分化的足细胞（~99% )。
[0019] 发明概述
[0020] 本文提供了将多能干细胞分化成表达SIX2的肾前体细胞的方法，该方法包括步 骤：
[0021] a)在多能培养基中提供多能干细胞单层，
[0022] b)在补充糖原合酶激酶3 (Gsk3a-b)的小分子抑制剂的引发培养基中溫育细胞，
[0023] C)通过在诱导培养基中溫育引发的细胞诱导分化。
[0024] 在一个实施方案中，肾前体细胞表达额外的标记基因WT1和/或SA化1。 阳0巧]在一个实施方案中，糖原合酶激酶3 (Gsk3a-b)的小分子抑制剂是3- (3-氨基-苯 基）-4-(1-甲基-1H-日引噪-3-基）-化咯-2, 5-二酬。
[00%] 在一个实施方案中，步骤a)的多能培养基是无血清培养基，其补充有化0-相关的 卷曲螺旋形成蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶家族蛋白激酶的抑制剂（ROCK激酶抑制剂）。
[0027] 在一个实施方案中，ROCK激酶抑制剂选自1- (5-异哇嘟横酷基）高赃嗦）、N-节 基-2-(喀晚-4-基氨基）嚷挫-4-簇酷胺）和（+)-佩-反式-4-(1-氨基乙基）-N-(4-化 晚基）环己烧簇酷胺二盐酸盐）。
[0028] 在一个实施方案中，步骤b)的引发培养基是补充膜岛素、转铁蛋白和孕酬的无血 清培养基。 W29] 在一个实施方案中，步骤b)的引发培养基额外包含重组骨形态发生蛋 白-4 度MP4)。
[0030] 在一个实施方案中，步骤a)包括在多能培养基中溫育细胞18小时到30小时。
[0031] 在一个实施方案中，步骤b)包括在引发培养基中溫育细胞2到4天。
[0032] 在一个实施方案中，步骤C)包括在诱导培养基中溫育细胞18到48小时。
[0033] 在一个实施方案中，诱导培养基是补充有重组骨形态发生蛋白-7度MP7)的无血 清培养基。
[0034] 在一个实施方案中，诱导培养基是补充有视黄酸的无血清培养基。
[0035] 在一个实施方案中，所述方法额外包括步骤
[0036] d)在适合足细胞增殖的条件下溫育步骤C)的产物。
[0037] 在一个实施方案中，多能干细胞是经诱导的多能干细胞。
[0038] 在一个实施方案中，经诱导的多能干细胞是人细胞。
[0039] 在一个实施方案中，从患有肾病的受试者获得经诱导的多能干细胞。
[0040] 在一个实施方案中，提供了通过根据本文所述的任一个实施方案的方法获得的表 达SIX2的肾前体细胞或经分化的足细胞。
[0041] 在一个实施方案中，提供了通过根据本文所述的任一个实施方案的方法获得的表 达SIX2的肾前体细胞或经分化的足细胞的生物库。
[0042] 在一个实施方案中，提供了通过根据本文所述的任一个实施方案的方法获得的表 达SIX2的肾前体细胞或经分化的足细胞或根据本文所述的任一个实施方案的方法获得的 表达SIX2的肾前体细胞或经分化的足细胞的生物库作为肾病的体外模型的用途。
[0043] 在一个实施方案中，提供了包含通过根据本文所述的任一个实施方案的方法获得 的表达SIX2的肾前体细胞或经分化的足细胞或根据本文所述的任一个实施方案的方法获 得的表达SIX2的肾前体细胞或经分化的足细胞的生物库的药物组合物。
[0044] 任一上述实施方案可W单独或组合存在。
[0045] 附图简述
[0046] 图1:通过基于图像的高内容分析做A)对BRY+，PAX2+，LIM1+，iPSCs细胞的定 量。人iPS细胞已经在单层条件下培养。定量图：在第1天在多能培养基中BRY+，PAX化， 和LIM1+阳性细胞的百分比。运些发现通过全基因组表达谱分析证实（数据未显示）。
[0047] 图2 :通过基于图像的高内容分析（肥A)定量BRY+，PAX2+，LIM1+，iPSCs衍生的细 胞。人iPS细胞已经在单层条件下分化。定量图：第4天在引发培养基中BRY+，PAX2+，和 LIM1+阳性细胞的百分比。运些发现通过全基因组表达谱分析证实（数据未显示）。 W4引 图3:通过基于图像的高内容分析（HCA)定量WT1+，SIX2+，SA化1+，和 PAX210W，iPSCs衍生的多能肾前体。人iPS细胞已经在单层条件下分化。主要小图：定量 图：第6天在诱导培养基中WT1+，SIX化，SA化1+，和PAX化阳性细胞的百分比。运些发现通 过全基因组表达谱分析证实（数据未显示）。
[0049] 图4:通过基于图像的高内容分析（肥A)定量WT1+,a-ACTINIM+,肥PRHIN+,POD 0CIN+和SYNAPT0P0DIN+，iPSCs衍生的功能足细胞。人iPS细胞已经在单层条件下分化。 主要小图：定量图：第13天在足细胞增殖培养基中WT1+,a-ACTINIM+,肥PRHIN+,P0D0CIN+ 和SYNAPT0P0DIN+阳性细胞的百分比。运些发现通过全基因组表达谱分析证实（数据未显 示）。
[0050] 图5 :足细胞分化方法的再现性，用作起始hESC。在足细胞分化方法期间受调节 的关键标志物的基于图像的高内容分析（HCA)定量。人胚胎干细胞系（来自Cellartis的 SA0