一种间充质干细胞表皮分化诱导剂及其应用方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于干细胞诱导分化技术领域，具体涉及一种间充质干细胞定向分化诱导 剂。
【背景技术】
[0002] 皮肤为人体最大的器官，总重量约占个体体重的16%，主要由表皮、真皮以及皮下 组织构成。临床上由于重度烧伤、慢性溃疡、外伤等造成的皮肤损伤，需要尽早促进创面愈 合，尽量减少瘫痕所造成的功能障碍。组织工程技术和再生医学的发展使新型皮肤再生产 品的开发成为可能。组织工程基本原理是将种子细胞在体外培养、扩增后，整合于预先设计 的生物学支架上构成细胞一支架复合体，然后植入机体相应的病损部位，修复组织缺损。组 织工程的三大要素包括种子细胞、支架材料以及有助于细胞生长分化的微环境。构建组织 工程皮肤所需要的最基本的种子细胞是表皮细胞，而表皮细胞是一种终末分化的细胞，在 体外培养一代即进入老化状态，且其分裂增殖速度较慢，培养条件严格，很难短时间扩增出 大量的细胞来满足皮肤组织工程的需要。
[0003] 间充质干细胞(MSCs)是一种具有多向分化潜能的干细胞，在胚胎发育中来源于中 胚层，小鼠的胚胎发育10天后开始出现，之后几乎分布于机体的所有器官与组织中。成体 MSCs主要存在于骨髓，脂肪，骨膜下以及各个器官和组织中的血管周围，另外，新生儿脐带、 胎盘、羊膜等也含有大量MSCs。MSCs具有分化为多种中胚层细胞系的潜能，包括成骨细胞， 脂肪细胞，软骨细胞，神经细胞，肝脏细胞，表皮细胞等。MSCs来源广泛且没有伦理限制，易 于分离和体外扩增，在经过多次分裂传代后仍保持多向分化潜能，至今为止的临床试验研 究未发现MSCs有严重副作用，因此，MSCs是一种非常理想的细胞治疗和再生医学的种子细 胞。
[0004] 目前文献报道的运用MSCs体外诱导表皮干细胞分化的研究报道不多，诱导方法 也比较类似，分化获得率也较低。运用较多的为条件培养基加表皮生长因子、碱性成纤维细 胞生长因子（bFGF)，辅以维甲酸（RA)，或应用转基因技术导入EGF，以bFGF诱导转染后的细 胞分化。例如有研究者使用皮肤组织匀浆液作为条件培养基并添加表皮生长因子（EGF)来 诱导干细胞的表皮分化，通过检测表皮干细胞的标志物CK19和CK14来证明MSCs在体外也 可以向表皮细胞分化，但是这种方法分化得率很低（CK19阳性率约为10%，CK14阳性率约为 12%)。也有研究者联合使用EGF和维甲酸来诱导脂肪MSCs分化为表皮细胞，诱导7天后可 以发现部少量细胞的形态发生变化，由梭形变成多边形，部分细胞形成卵石铺路样，对CK19 的检测发现阳性率约为12%。
[0005] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明人经过多次大量实验，意外发现KGF、 BMP-4、TOGF-AB、VEGF、IL-2、Forskolin联合可以高效诱导MSCs分化为表皮细胞。其中， BMP(骨形态发生蛋白）是TGF-P超家族的成员之一，对骨骼的胚胎发育和再生修复起重 要作用。BMP表达于众多胚胎器官和组织，不仅参与骨骼的发生与形成，而且与众多器官 密切相关，如肾、肺、眼、神经系统、皮肤、性腺等。BMP是生命过程中多方面的调节因子，参 与增殖、分化、凋亡和形态发生等，各成员对不同组织可能有不同的作用。细胞因子KGF、TOGF-AB、VEGF、IL-2可以维持表皮干细胞微环境，同时可以刺激其增殖、发育。Forskolin 是一种常用的腺苷酸环化酶激活剂，可以通透细胞，激活腺苷酸环化酶（adenylyl cyclase)，从而升高细胞内的cAMP水平。而他们组合起来，可以协同诱导MSCs分化为表皮 细胞。
【发明内容】
[0006] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供间充质干细胞表皮分化诱 导剂，该诱导剂能够将间充质干细胞定向诱导分化为表皮细胞。目前多数间充质干细胞表 皮分化诱导剂存在诱导时间过长，诱导效率低，诱导后获得表皮细胞活性差。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种间充质干细胞表皮分化诱导剂， 由KGF、BMP-4、PDGF-AB、VEGF、IL-2、Forskolin组成，在加入完全培养基后，各成分作用 浓度依次为KGF20 ~30yg/L、BMP-4 5 ~10yg/L、PDGF-AB5 ~10yg/L、VEGF10 ~ 20yg/L、IL-2 5 ~10yg/L、Forskolin1 ~ 2mg/L〇
[0008] 优选的，一种间充质干细胞表皮分化诱导剂，在加入完全培养基后，各成分作用 浓度依次为KGF25yg/L、BMP-4 8yg/L、PDGF-AB7yg/L、VEGF12yg/L、IL-2 7yg/L、 ForskolinL2mg/L〇
[0009] 本发明的间充质干细胞表皮分化诱导剂的应用方法，将间充质干细胞表皮分化诱 导剂各成分按照作用浓度要求分别加入完全培养基中，完全培养基为Keratinocyte-SFM、 人间充质干细胞专用无血清培养基或者DMEM/F12+10%FBS。
[0010] 本发明的间充质干细胞表皮分化诱导剂，采用细胞因子联合小分子化合物，高效 诱导间充质干细胞分化为表皮细胞，诱导分化效率极大提高，诱导后细胞活性强，且无需细 胞转染，故无基因改变及罹患癌症风险，无伦理问题，安全性高。
【附图说明】
[0011] 图1是脂肪间充质干细胞，P3,（X200); 图2间充质干细胞诱导后CK19阳性表皮细胞，呈红色荧光（X200); 图3间充质干细胞诱导后P63阳性表皮细胞，呈红色荧光（X200); 图4间充质干细胞诱导后的0 1-integrin阳性表皮细胞，呈红色荧光（X200); 图5本发明诱导剂与传统方法诱导脂肪间充质干细胞诱导效率的比较； 图6本发明诱导剂与传统方法诱导脐带间充质干细胞诱导效率的比较。
【具体实施方式】
[0012] 下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。实验所用器具仪器试剂 皆可通过商业途径获得。
[0013] 实施例1 一种间充质干细胞表皮分化诱导剂，其特征在于：所述诱导剂由KGF、 BMP-4、PDGF-AB、VEGF、IL-2、Forskolin组成。
[0014] 实施例2间充质干细胞表皮分化诱导剂，将下列原料按其各自特性进行溶解，以 人间充质干细胞无血清培养基（L0NZA，货号00190632)为基质，使各组分含量如下列定容 至1000ml:KGF(Sigma，K1751-10yg)20yg、BMP-4 (Sigma，SRP3016-10yg)5yg、PDGF-AB(PeproTech，96-100-00AB-10yg) 5yg、VEGF(PeproTech，96-100-20-10yg) 10yg、IL-2 (PeproTech，96-200-02-50yg) 5yg、Forskolin(Abeam，abl20058_100mg)lmg，混勾后过 滤除菌。
[0015] 实施例3间充质干细胞表皮分化诱导剂，将下列原料按其各自特性进行溶解，以 DMEM/F12+10%FBS为基质，使各组分含量如下列定容至1000ml:KGF(Sigma，K1751-10yg) 30yBMP-4 (Sigma,SRP3016-10yg) 10yPDGF-AB(PeproTech,96-100-00AB-10yg) 10yg、VEGF(PeproTech，96-100-20-10yg) 20yg、IL-2 (PeproTech，96-200-02-50yg) 10yg、Forskolin(Abeam，abl20058_100mg) 2mg，混勾后过滤除菌。
[0016] 实施例4间充质干细胞表皮分化诱导剂，将下列原料按其各自特性进行溶解，以 Keratinocyte-SFM(Gibco, 170005-42)为基质，使各组分含量如下列定容至1000ml:KGF (Sigma，K1751-10yg)25yg、BMP-4 (Sigma，SRP3016-10yg) 8yg、PDGF-AB(P印roTech， 96-100-00AB-10yg)7yg、VEGF(PeproTech，96-100-20-10yg)12yg、IL-2 (PeproTech， 96-200-02-50yg) 7yg、Forskolin(Abeam，abl20058_100mg) 1. 2mg，混勾后过滤除菌。 [0017]实施例5采用实施例4制备的诱导剂，对脂肪间充质干细胞(AD-MSCs)进行表皮 细胞诱导分化实验 1、AD-MSCs体外