-1H-日引噪-3-基）-1H-化 咯-2, 5-二酬（SB216763)，3-[ (3-氯-4-径苯基）氨基]-4-(2-硝基苯基）-1H-化 咯-2,5-二酬（SB415286)，N6-{2-[4-(2,4-二氯-苯基）-5-咪挫-1-基-喀 晚-2-基氨基]-乙基-3-硝基-化晚-2, 6-二胺甜C1，3-咪挫并[1，2-a]化 晚-3-基-4-[2-(吗嘟-4-幾基）-251，2,3,4-四氨-[1，4]二氮杂拳并[6,7，l-hi] 吗I噪-7-基]-化咯-2, 5-二酬，9-漠-7, 12-二氨-吗I噪并化2-d]山苯并氮杂 革-6巧H)-酬化e吨aullone)，9-漠-7,12-二氨-化晚并巧'，2' :2,3]氮杂拳 并[4, 5-b]日引噪-6巧H)-酬（CHIR99021)和（3-(3-氨基-苯基）-4-(1-甲基-1H-吗I噪-3-基）-化咯-2, 5-二酬（CP21R7,本文也称作"化合物21";见例如L.Gonget曰1 ; Bioo;rganic&MedicinalQiemistryLetters20 (2010), 1693-1696)。在一个实施方案中， CDC-样激酶1 (akl-2-4)抑制剂选自苯并嚷挫和3-氣-N-[l-异丙基-6-(1-甲基-化 晚-4-基氧）-1，3-二氨-苯并咪挫-(2巧-亚基]-5- (4-甲基-1H-化挫-3-横酷基）-苯 甲酯胺。在一个实施方案中，促分裂原活化蛋白激酶15(Mapkl5)抑制剂选自4-(4-氣苯 基）-2- (4-甲基亚硫酷基苯基）-5- (4-化晚基）-1H-咪挫（SB203580)和5-异哇嘟横酷胺。
[0077] 在一个实施方案中，双特异性酪氨酸-灯)-憐酸化调节的激酶5(Dyrkla-b4)抑 制剂选自6-[2-氨基-4-氧代-4H-嚷挫-巧幻-亚基甲基]-4-(四氨-化喃-4-基氧）-哇 口林-3-腊。
[0078] 在一个实施方案中，smoothened激活子是化rmo巧hamine(2-(1-糞氧 基）-6-(4-吗嘟代苯胺基）-9-环己基嚷岭。β-连环蛋白（或γ-连环蛋白）和辅激活 蛋白CBP(CR邸结合蛋白）与ρ300巧1Α结合蛋白ρ300)之间相互作用的调节剂的实例是 IQ-1 (2- (4-乙酷基-苯基偶氮）-2-化3-二甲基-3, 4-二氨-2Η-异哇嘟-(1Ε)-亚基]-乙 酷胺，和ICG-001 ((6S，9aS) -6- (4-径基-苄基）-8-糞-1-基甲基-4, 7-二氧代-六氨-15 化嗦并[l，2-a]喀晚-1-簇酸苯甲酯胺（W02007056593)。
[0079] 在一个实施方案中，引发培养基是补充膜岛素、转铁蛋白和孕酬的无血清培养 基。在一个实施方案中，无血清培养基补充10-50μg/ml膜岛素、10-100μg/ml转铁 蛋白和10-50nM孕酬，优选30-50μg/ml膜岛素、20-50μg/ml转铁蛋白和10-30nM孕 酬。适于引发的无血清培养基的实例是补充N2和B27(都来自Gibco)的N2B27培 养基（N2B27 是DMEM/F12 (Gibco,化isley,UK)的 1:1 混合物），N3 培养基（由DMEM/F12 (Gibco,化isley，UK)，25μg/ml膜岛素，50μg/ml转铁蛋白，30nM亚砸酸钢，20nM 孕酬，lOOnM腐胺（Sigma)组成），或 25NeuroOllt⑥NS-AProliferation培养基 (StemcellTechnologies)。在一个实施方案中，引发培养基是补充膜岛素、转铁蛋白、孕酬 和糖原合酶激酶3 (Gsk3a-b)的小分子抑制剂的无血清培养基。
[0080] 优选地，小分子抑制剂是（3- (3-氨基-苯基）-4- (1-甲基-1H-吗I噪-3-基）-化 咯-2, 5-二酬，在本文也称作CP21R7。在一个实施方案中，引发培养基是包含10-50μg/ ml膜岛素，10-100μg/ml转铁蛋白和10-50nM孕酬和0. 5-4μΜCP21R7 (3-(3-氨基-苯 基）-4-(1-甲基-IH-吗I噪-3-基）-化咯-2, 5-二酬）的无血清培养基。在一个实施方案 中，引发培养基包含ΙμΜCP21R7。在一个实施方案中，本文所述的任一实施方案的引发培 养基额外包含重组骨形态发生蛋白-4度MP4)。在一个优选实施方案中，引发培养基是包含 10-50μg/ml膜岛素，10-100μg/ml转铁蛋白，10-50nM孕酬，0.5-4μMCP21R7(3-(3-氨 基-苯基）-4-(1-甲基-1Η-吗I噪-3-基）-化咯-2, 5-二酬）和10-50ng/ml重组骨形态 发生蛋白-4度MP4)的无血清培养基。
[0081] 在一个实施方案中，上文所述方法的步骤b)包括在引发培养基中溫育细胞至少3 天（72小时）。在一个实施方案中，上文所述方法的步骤b)包括在引发培养基中溫育细胞 2到4天（48小时到96小时）。在另一实施方案中，上文所述方法的步骤b)包括在引发培 养基中溫育细胞，其中引发培养基是补充CP21R7 (3-(3-氨基-苯基）-4-(1-甲基-1H-吗I 噪-3-基）-化咯-2, 5-二酬）的无血清培养基。优选地，引发培养基补充0. 5 - 4μΜ CP21R7 (3-(3-氨基-苯基）-4-(1-30甲基-1Η-吗I噪-3-基）-R比咯-2, 5-二酬），最优 选l-2μMCP21R7(3-(3-氨基-苯基）-4-α-甲基-lH-吗|噪-3-基）-化咯-2,5-二 酬）。在一个实施方案中，引发培养基额外包含重组骨形态发生蛋白-4度MP4)。在另一实 施方案中，上文所述方法的步骤b)包括在引发培养基中溫育细胞，其中引发培养基是补充 CP21R7 (3- (3-氨基-苯基）-4- (1-甲基-1H-日引噪-3-基）-化咯-2, 5-二酬）的无血清培 养基，并且溫育细胞3天（72小时）。在一个此类实施方案中，引发培养基额外包含重组骨 形态发生蛋白-4度MP4)。
[0082] 在另一实施方案中，上文所述方法的步骤b)包括在引发培养基中溫育细胞，其 中引发抬养基是补充CP21R7 (3-(3-氨基-苯基）-4-(1-甲基-1H-日引噪-3-基）-R比 咯-2, 5-二酬）的无血清培养基，并且溫育细胞2到4天（48小时到96小时）。在一个此 类实施方案中，引发培养基额外包含重组骨形态发生蛋白-4度MP4)。
[0083] 如本文所用到"诱导培养基"指用于在单层上将引发的细胞诱导成SIX2和/或WT1 和/或SA化1阳性肾前体细胞的任何化学成分确定的培养基。在一个实施方案中，肾前体 细胞表达所有Ξ种标记基因SIX2,WT1和SALL1并且也称作SWS+肾前体细胞。在一个实施 方案中，肾前体细胞是后肾间充质细胞。在另一实施方案中，肾前体细胞下调间介中胚层的 标记基因。所W，在一个实施方案中，肾前体细胞仅W极低水平表达PAX2。在一个实施方案 中，肾前体细胞不表达LIM1和/或BRY。
[0084]适于诱导的培养基的实例是DEMEM/F12,RPMI1640 (Invitrogen)或William'SE 培养基（Invitrogen)。
[0085] 在一个实施方案中，诱导培养基补充骨形态发生蛋白度MP)，像BMP4，BMP7或其他 BMPs像BMP2，BMP3，BMP5，BMP6，BMPSa，BMPSb,或BMP9。
[0086] 优选地，诱导培养基是补充BMP7的培养基。在一个此类实施方案中，诱导培养基 补充 20 - 80ng/mlBMP7,优选 50ng/mlBMP7。
[0087] 使用本文给出的新方法，现在可能从多能干细胞分化表达SIX2的肾前体细胞，产 率高达95%。步骤C)的产物可W在细胞培养物中容易地鉴定为SIX2和WT1和/或SA化1 阳性细胞。
[0088] 在一个实施方案中，诱导培养基额外包含视黄酸（RA)，像全反式视黄酸或9-顺式 视黄酸。在另一实施方案中，诱导培养基包含视黄酸抑制剂或视黄酸激动剂。视黄酸抑制 剂和视黄酸激动剂是本领域公知的。
[0089] 优选地，诱导培养基是补充RA的培养基。在一个此类实施方案中，诱导培养基补 充 50-200nMRA,优选lOOnMRA。
[0090] 在一个实施方案中，诱导培养基补充RA和BMP7。
[0091] 在一个实施方案中，诱导培养基额外包含1-5%血清，优选2. 5%血清。其中可用 的血清是例如本领域公知的胎牛血清。在另一实施方案中，诱导培养基补充氨基酸，例如， 来自Sigma-Al化ich(目录号M7145)的非必需氨基酸溶液。
[0092] 在另一实施方案中，诱导培养基额外包含β-琉基乙醇。
[0093] 在一个实施方案中，上述方法的步骤C)包括在诱导培养基中溫育细胞2天（48小 时）。
[0094] 在一个实施方案中，上述方法的步骤a)到C) 一起花了 6天。
[0095] 在一个实施方案中，上述实施方案中所述的方法可用于将多能干细胞分化为足细 胞。在一个实施方案中，任一上述实施方案中所述的方法额外包括步骤：
[0096] d)在适于足细胞增殖的条件下溫育步骤C)的产物。
[0097] 典型地，收获并在化学成分确定的增殖培养基中增殖步骤C)中获得的SWS+细胞。 在一个实施方案中，步骤d)包括将步骤C)中获得的细胞在增殖培养基中溫育24-168小 时，优选48-96小时。
[0098] 如本文所用的增殖培养基是补充生长因子和/或增强足细胞的增殖和存活的小 分子的培养基。
[0099] 在一个实施方案中，增殖培养基是化学补加培养基（SP培养基）。本文可用的SP 培养基是例如DMEM/F12 培养基（例如Invitrogen或GibcoCatnum. 31331-028)或RPMI 1640(GibcoCatnum. 61870-010)或DMEM培养基）。在一个实施方案中，增殖培养基补充 2-10%血清，例如，2-10%胎牛血清。在一个实施方案中，增殖培养基补充Knock-out血清 替代品（Knock-outserumreplacement)(例如，来自Invitrogen,目录号 10828028)。
[0100] 在另一实施方案中，增殖培养基补充0. 1-0. 5mMRA，优选0.ImMRA。在另一实施 方案中，增殖培养基补充10-200nM维生素D3,优选lOOnM维生素D3。在一个实施方案中， 增殖培养基补充RA和维生素D3。在一个实施方案，增殖培养基进一步包含稳定的谷氨酷 胺。在优选实施方案中，增殖培养基是补充10 %血清，lOOnM维生素D3和0.ImM视黄酸的 DMHM/F12培养基。 阳101 ] 通过本文所述方法获得的肾前体细胞和足细胞可W扩增数代。 阳102] 任一上述实施方案可W单个或组合存在。 阳103]在本发明的一个实施方案中，提供了产生患者特异性或健康个体特异性肾前体细 胞或足细胞的方法。为此，用本文所述方法使从患者或健康个体得到的人诱导的多能干细 胞（iPSCs)分化成肾前体细胞或足细胞。通过对从患者或健康个体获得的体细胞重编程序 为多能干细胞，通过本领域已知的方法获得患者特异性人iPSCs。例如，成纤维细胞、角质 形成细胞或脂肪细胞可W通过皮肤活组织检查从需要治疗的个体或健康个体获得并通过 本领域已知的方法重编程序成经诱导的多能干细胞。适合作为经诱导的多能干细胞的其 他体细胞是从血液样品获得的白细胞或从尿样获得的上皮细胞或其他细胞。患者特异性诱 导的多能干细胞然后通过本文所述的方法分化成患者特异的或健康个体特异性肾前体细 胞或足细胞。在本发明的另一方面，提供了通过前述方法任一项产生的肾前体细胞或足细 胞群体。优选地，肾前体细胞或足细胞的群体是患者特异的，例如，来自从患病个体获得的 iPSCs。在另一实施方案中，从健康个体获得肾前体细胞或足细胞的群体。
[0104] 患者来源的肾前体细胞或足细胞代表疾病相关的体外模型，用于研究肾病的病理 生理学，像急性肾功能衰竭/急性肾损伤、奥尔波特综合征、血管紧张肤抗体和局灶性节段 性肾小球硬化症、AP0L1突变、CFHR5肾病、己特综合征、塌陷性肾小球病、糖尿病和与CMV相 关的糖尿病性肾病、法布里病、肾小球疾病、HIV相关肾病化IVAN)、脂蛋白肾小球病、狼疮 肾病、狼疮肾炎、膜性增生性肾小球肾炎、结节性肾小球硬化、感染后肾小球肾炎、链球菌感 染后肾小球肾炎。在一个实施方案中，通过该方法得到的肾前体细胞或足细胞用于筛选逆 转、抑制或预防肾细胞功能障碍引起的肾病的化合物，所述肾病为例如慢性肾疾病（CDK)、 局灶性节段性肾小球硬化症（FSG巧、膜性增生性肾小球肾炎、多囊肾病（PKD)和与2型糖尿 病相关的糖尿病肾病。优选地，通过本文所述的本发明方法获得的肾前体细胞或足细胞来 自患病的受试者。在另一实施方案中，通过该方法获得的肾前体细胞或足细胞用于筛选和 评估新祀标和用于治疗糖尿病和糖尿病性肾病的化合物。优选地，通过本文所述的本发明 的方法获得的肾前体细胞或足细胞来自受肾疾病影响的个体，所述肾疾病像例如慢性肾疾 病仰K)、局灶性节段性肾小球硬化症（FSGS)、膜性增生性肾小球肾炎、多囊肾病（PKD)和 与2型糖尿病相关的糖尿病肾病。分化来自患病受试者的肾前体细胞和/或足细胞代表在 人背景范例中早期评估药物安全性的独特机会。在另一实施方案中，通过该方法获得的足 细胞用作肾单位的体外模型。
[01化]本发明提供了为患者供应来自具有相同的HLA类型的健康个体的适于移植的特 定足细胞或相容细胞的方法，所述细胞均在无异物条件下得到。"无异物培养条件"指包含 仅仅人和重组来源组分的培养基和用于附着的基质。从而，防止了与异种病原体污染的风 险并且肾细胞安全用于再生性药物。用本文所述的方法使患者特异性诱导的多能干细胞 (iPSCs