细胞剥离方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种将使用培养容器培养的粘附培养系细胞从培养容器剥离的方法，特别涉及将使用包含具有挠曲性的膜的密闭体系的培养容器培养的粘附培养系细胞从培养容器剥离的方法。
【背景技术】
[0002]近年来，在医药品的生产、基因治疗、再生医疗、免疫疗法等领域中，要求在人工环境下高效地大量培养细胞和组织、微生物等，使用具有透气性的培养袋，在封闭体系中自动地进行细胞的大量培养。
[0003]然而，最近特别是使用具有万能分化性的iPS细胞、或具有变为属于间充质的细胞的分化能力的间充质干细胞等的再生医疗等研究开发迅速地开展，而此种研究开发中使用的细胞的大部分是粘附培养系细胞。
[0004]粘附培养系细胞是附着于培养容器增殖的细胞，因此与在培养液内以浮游状态增殖的浮游培养系细胞不同，在培养后需要从培养容器剥离。由此，以往为了使粘附培养系细胞能够进行剥离操作，多在Petri培养皿等开放体系的培养容器中培养。
[0005]然而，在Petri培养皿中进行大量培养繁琐且花费工夫，因此今后为了更高效地大量培养，希望使用封闭体系的培养袋进行培养。
[0006]另外，在粘附培养系细胞的培养中，需要仅培养状态良好的细胞等选择出的细胞，因此还要求从培养容器仅剥离所需的部分。
[0007]作为以往的细胞剥离方法，首先可以举出借助胰蛋白酶处理的方法。该方法中，通过利用作为蛋白质分解酶的胰蛋白酶，将粘附培养系细胞与培养容器的粘附因子分解，而将细胞剥离。
[0008]S卩，如图8所示，向加入了培养液2的Petri培养皿10中接种粘附培养系细胞3而使之增殖后，从Petri培养皿10中除去培养液2 (1)。然后，用磷酸缓冲生理盐水(PBS溶液)清洗培养液成分(2)，注入胰蛋白酶溶液(3)。通过在培养箱内保持数分钟，而将粘附因子分解，粘附培养系细胞3从Petri培养皿10纷纷剥落(4)。最后，向Petri培养皿10中注入培养液2，使胰蛋白酶失活，将粘附培养系细胞3与培养液2 —起回收。
[0009]根据此种胰蛋白酶处理，可以将接触性培养细胞3从培养容器剥离。
[0010]另外，作为以往的细胞剥离方法，还有使用细胞刮棒物理地刮取细胞的方法(参照专利文献1)。根据该方法，与胰蛋白酶处理相比操作简单，如果是一定程度内，则也可以剥离目标范围的细胞。
[0011]此外，在专利文献2中，公开有如下的方法，S卩，利用具有探针的扫描型探针显微镜，对特定的细胞以预先确定的力按压探针而施加物理的刺激，将细胞从基板上剥离。根据该方法，可以选择性剥离细胞。
[0012]现有技术文献
[0013]专利文献1:日本实用新型第2531969号
[0014]专利文献2:日本专利第4831543号
【发明内容】
[0015]发明所要解决的问题
[0016]然而，在胰蛋白酶处理中，如果培养箱内的保持时间过长，则会分解至细胞膜，会有损伤细胞的情况。另外，操作繁琐，很难应用于培养袋。此外，很难仅将一部分细胞群剥离，不能满足希望仅剥离所需的部分的要求。
[0017]另外，专利文献1中记载的使用细胞刮棒的方法适合于开口部大的开放形的培养容器，存在有难以适用于开口部小的培养袋的问题。
[0018]另外，专利文献2中记载的利用具有探针的扫描型探针显微镜的方法由于使用探针，因此难以适用于培养袋，另外由于是将细胞一个个选择性剥离，因此无法将培养袋中大量培养的粘附培养系细胞高效地剥离。
[0019]由此，希望有能够将使用培养袋培养的粘附培养系细胞从培养袋选择性并且高效地剥离的技术。
[0020]因而，本发明人等对可以适用于培养袋的细胞剥离方法进行了深入研究。由此发现，通过使与粘附培养系细胞所附着的培养袋的膜的面相面对的膜的面接触粘附培养系细胞、并对粘附培养系细胞施加压力，就可以将粘附培养系细胞从培养袋的内面剥离，从而完成了本发明。
[0021]S卩，本发明的目的在于，提供一种细胞剥离方法，其可以将使用包含具有挠曲性的膜的培养容器培养的粘附培养系细胞不造成损伤地从培养容器选择性并且高效地剥离。
[0022]用于解决问题的方法
[0023]为了达成上述目的，本发明的细胞剥离方法是将附着在包含具有挠曲性的膜的培养容器培养的粘附培养系细胞从培养容器剥离的细胞剥离方法，通过使与粘附培养系细胞所附着的培养容器的膜的面相面对的培养容器的膜的面接触粘附培养系细胞、并对粘附培养系细胞施加压力，而将粘附培养系细胞从培养容器剥离。
[0024]发明效果
[0025]根据本发明，可以提供一种细胞剥离方法，其可以将使用包含具有挠曲性的膜的培养容器培养的粘附培养系细胞不造成损伤地容易地从培养容器选择性并且高效地剥离。
【附图说明】
[0026]图1是表示本发明的第一实施方式的细胞剥离方法的工序的图。
[0027]图2是表示本发明的第一实施方式的细胞剥离方法中的推压构件的例子的图。
[0028]图3是表示本发明的第二实施方式的细胞剥离方法的工序的图。
[0029]图4是表示本发明的第三实施方式的细胞剥离方法的工序的图。
[0030]图5是表示实施例1的结果的显微镜照片的图。
[0031]图6是表示实施例2的实施的样子及结果的显微镜照片等的图。
[0032]图7是表示将利用以往的方法剥离并进行继代培养的粘附培养系细胞与实施例2的结果所得的粘附培养系细胞以相同密度接种而分别培养的结果的显微镜照片的图。
[0033]图8是表示以往的借助胰蛋白酶处理的细胞剥离方法的图。
【具体实施方式】
[0034]本发明的细胞剥离方法是将附着于包含具有挠曲性的膜的培养容器培养的粘附培养系细胞从培养容器剥离的细胞剥离方法，通过使与粘附培养系细胞所附着的培养容器的膜的面相面对的培养容器的膜的面接触粘附培养系细胞、并对粘附培养系细胞施加压力，而将粘附培养系细胞从培养容器剥离，只要是此种方法即可，并不受其他的构成特别限定。
[0035]S卩，作为对粘附培养系细胞施加压力的途径，只要是可以使与粘附培养系细胞所附着的培养容器的膜的面相面对的培养容器的膜的面接触粘附培养系细胞、并对粘附培养系细胞施加压力即可，既可以通过从培养容器的外部施加压力而对细胞施加压力，也可以通过将培养容器内的空气设为负压而对细胞施加压力。
[0036]另外，作为从培养容器的外部施加压力的方法，也可以利用推压构件等推压培养容器、或利用空气压等推压培养容器。
[0037]以下，对本发明的实施方式进行具体说明。
[0038][第一实施方式]
[0039]首先，参照图1及图2对本发明的第一实施方式的细胞剥离方法进行详细说明。
[0040]在图1的⑴中，示意性地表示出向包含具有挠曲性的膜的培养容器1 (培养袋)中封入培养液2和粘附培养系细胞3并载放在装载台4上、将推压构件5配置于培养容器1的上方的样子。粘附培养系细胞3附着在培养容器1内的膜的底面而被培养。
[0041]然后，如图1的⑵所示，利用推压构件5，从上方推压培养容器1。此时，使培养容器1内的膜的上表面接触粘附培养系细胞3，对粘附培养系细胞3施加不会损伤粘附培养系细胞3的程度的压力。
[0042]此后，如图1的(3)所示，当使推压构件5离开培养容器1时，粘附培养系细胞3就从培养容器1内的膜的底面剥落。
[0043]此处，附着于培养容器1内的膜的底面的粘附培养系细胞3即使从培养容器1下方摩擦也无法剥离。即，即使从培养容器1的外部对粘附培养系细胞所附着的培养容器1的膜的面施加力，也只会对膜造成损伤，或将其拉长，无法剥离粘附培养系细胞3。
[0044]与此相对，根据上述的本实施方式的细胞剥离方法，可以不使附着于培养袋内的粘附培养系细胞3损伤，在一定程度上选择性并且高效地剥离目标范围的细胞。
[0045]虽然其理由还不明确，然而可以推测，通过像本实施方式那样使培养容器1的膜接触粘附培养系细胞3并施加压力，就会对粘附培养系细胞作用大于粘附培养系细胞3与培养容器1的粘附力的应力，从培养容器1分离粘附培养系细胞3。
[0046]培养容器1是以软包装材料作为材料制成袋状的、包含具有挠曲性的膜的培养袋。培养容器1由于是用于粘附培养系细胞3的培养，因此优选具有透气性，并且为了可以确认内容物，优选一部分或全部具有透明性。作为满足此种条件的膜的材料，例如可以举出聚烯经、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、苯乙烯系弹性体、聚酯系热塑性弹性体、硅酮系热塑性弹性体、硅橡胶等。
[0047]另外，为了可以使粘附培养系细胞3附着于培养容器1内，需要使培养容器1内