专利名称：用红外光谱检测被剥离的细胞中存在异常的方法
技术领域：
本发明涉及用红外光谱检测被剥离的细胞中存在异常的一种方法。
众所周知，检查一些被剥离的组织或细胞样品中的表示特征的瘤细胞使得能诊断是否为恶性，这些被剥离的组织或细胞样品例如可来自各种人体器官或组织的分泌物、渗出物、漏出物、刮下来的东西或刷下来的东西。已发现表皮剥落细胞学在检测早期子宫和子宫颈癌中很有价值，以至通常将它作为对所有成年妇女的每年度检查的常规部分来完成，参见“病理检查”，“表皮剥落细胞学研究”，第24章，362至365页。
被剥离的组织或细胞样品可以从下述这些东西得到，例如，气管、支气管、胃、直肠和结肠、泌尿道(Urinary tract)、浆膜囊流体(Serous sac fluids)、囊肿流体、滑液流体、腺分泌物及渗出物。获得、收集、若必要的话以及保存这些样品的方法，可随意变化。
将每个收集到的样品原封不动地匀均散布一层到一干净的显微镜载物片上，并在例如乙醇-乙醚固定液中浸没约1小时。在固定后，不允许弄干，将上述层涂上甘油，并将该层夹在两玻璃载物片之间。然后，将这些载物片送到一实验室染色，并由一些经过训练的、有经验的病理学家或细胞学家作显微诊断。
被剥离的组织或细胞样品的显微诊断是有用的，这诊断性的实验结果分析
ⅰ)由熟练人员完成，ⅱ)不完全可靠，这是由于例如丰富的粘液、毛滴虫属感染或萎缩，以及ⅲ)不能精确检查例如恶化前的或早期恶性阶段中组织或细胞中的恶性。
需要一种方法检测被剥离的细胞中存在异常，其特点是ⅰ)对上述样品的一种简单试验及其实验结果分析，能由没有医学技能的并经过相当短的培训过程后的人员完成，ⅱ)上述试验结果的适当小心分析是可靠的，且ⅲ)能在恶化前的或早期恶性阶段检查组织或细胞中的恶性。
在申请人的待决的在加拿大的专利申请(申请号2，008，831-1，申请日1990年1月29日)“用红外光谱检测天然的或被培养的形式的生物组织及细胞中存在异常的方法”(P.T.T.Wong及B.Rigas)中，已提出用红外光谱检测天然的及被培养的形式的生物组织和细胞(例如，癌组织或细胞)中存在异常。将一束红外光照射在以天然的或被培养的形式包含待测试细胞的的一种组织或细胞样品上，并且通过确定红外吸收中是否变化，在至少一个频率范围检测，这红外吸收变化是由于上述样品中所存在的至少一种分子功能团的振动而出现的，所述样品表征了上述异常。
P.T.T.Wong及B.Rigas所教导的方法被用于活体组织或被培养的细胞的例子中。具体说，在第7页第20行到第8页第36行，P.T.T.Wong及Rigas检查在肠切除后由结肠粘膜立即得到的结肠直肠(colorectal)癌，即在外科手术切除一部分或一段肠后立即由结肠粘液膜得到的结肠直肠癌。
根据本发明，已经发现可以通过对被剥离的细胞的红外吸收特性的光谱分析，检测此被剥离的细胞中存在异常。粘蛋白、水、无机盐、上皮细胞、红血细胞及液体的白细胞并不产生上述细胞的红外光谱吸收特性的任何虚假解释。
本发明提供了一种用红外光谱检测被剥离的细胞中存在异常的方法，这方法包括a)将一红外光束照射被剥离的细胞的一个样品，而且b)通过该样品的红外光谱分析确定此样品中是否存在异常，这分析是在至少一个频率范围，以确定所述红外光谱吸收特性中是否至少有一种变化已出现，这种变化是由于上述特性异常的样品中至少一种分子功能团的振动而出现。
所述红外吸收特性中的至少一种变化可以是在某一特定频率处的吸收强度变化、某一特定吸收出现时的频率变化或施加到上述功能团上的不同压力引起频率变化，在此频率出现一特定吸收。
上述分子功能团可以是下述分子中的至少一种碳水化合物、核酸、组织蛋白质或膜酯类。
上述功能团可以是核酸中的磷酸二酯基、组织蛋白质和碳水化合物中的一个C-OH基或酯类中的一个CH2基。
上述功能团可以是下述这组功能团中所选出的至少一种，这组功能团有碳水化合物、核酸中的磷酸二酯基、组织蛋白质或碳水化合物中的COH基以及脂类的CH2基。
上述样品可以是一Papanicolau涂片。
上述样品可以是一子宫颈的样品。
上述样品可以是一子宫颈内的样品。
上述样品可以是一子宫颈外的样品。
上述样品可以是一阴道样品。
上述样品可以是一子宫样品。
附图中将以举例方式说明本发明的实施例。
图1是用红外光谱检测被剥离的细胞中存在异常的一种仪器的方框图。
图2显示了频率范围为950到1350cm-1时的红外光谱，从正常的健康的被剥离的子宫颈细胞样品所得到的红外光谱用---表示，而从用通常的细胞学方法诊断为恶性的被剥离的子宫颈样品所得到的红外光谱用-表示。
图3至图5分别示出了在健康的被剥离的子宫颈细胞样品及那些用通常的细胞学方法诊断为恶性的被剥离的子宫颈样品之间、在红外波带为～1082cm-1及～1155cm-1处的频率位移以及在红外波带为～1025cm-1及～1082cm-1之间的强度比变化。
图6示出了对于～1240cm-1波带、被放大并被叠加的、图2所示红外光谱。
图7示出了对于1190到1275cm-1频率区域中的上述波带，图2所示红外光谱的三次幂所派生的谱。
图8示出了被剥离的子宫颈组织的细胞中核酸的PO2基振动频率对压力的依赖性的比较。
图9是在正常的健康的被剥离的子宫颈细胞样品与那些用通常的细胞学方法诊断为恶性的被剥离的子宫颈细胞样品之间、对于1140cm-1到1185cm-1频率区域中的上述那些红外波带的放大。
图10示出了图9所示的红外光谱相应的三次幂所派生的谱。
图11示出了在正常的健康的被剥离的子宫颈组织样品与用通常的细胞学方法诊断为恶性的子宫颈组织样品之间、对于1140cm-1到1190cm-1频率范围中C-O延伸模式的各组成波带的频率对压力的依赖性的比较。
图12示出了在正常的被剥离的子宫颈组织样品与用通常的细胞学方法诊断为恶性的被剥离的子宫颈组织样品之间、膜脂类中亚甲基链的CH2的弯曲模式对压力依赖性的比较。
图13显示了对用通常的细胞学方法诊断为正常、恶性及发育异常的被剥离的子宫颈样品、对950cm-1到1350cm-1频率范围中的上述红外光谱的比较。
图14显示了由健康的被剥离的阴道细胞样品与用通常的细胞学方法诊断为恶性的被剥离的阴道细胞样品所得到的、在950到1，350cm-1频率范围中的红外光谱。
现在参考图1，图1显示了一红外光源1、一透镜2、一样品容器和支架4、一红外光谱仪6、一计算机8及一读出装置10。
操作时，将一被剥离的组织或细胞样品放入样品容器和支架4，来自光源1的、已由透镜2聚焦的一束红外光，穿过样品容器和支架4中的上述样品。该样品的任何红外吸收都由红外光谱仪6检测，然后顺次由计算机计算出该红外吸收，以在读出装置10给出读数。可以安排计算机读数直接指示上述样品是否为一正常健康的样品或是一包含有异常(即良性、发育异常或恶性)的样品。
在证实本发明的试验中，如图1所说明的那样，从被剥离的子宫颈细胞样品得到红外(IR)光谱，这被剥离的子宫颈细胞样品是从25个女性身上收集来的，这25个女性在标准的“刮削”或“刷”程序后都经受了监视性的Papanicolaou试验。这些样品含有上皮细胞、炎性细胞、红血细胞及作为正常植物群的组成部分的细菌。这些试验表明，由两个独立的观察者半定量的、在所有样品中存在有不同数量的非上皮细胞，在所研究的光谱区域中，对红外光谱的影响并未达到任何有意义的程度，各对照样品中所研究的红细胞的溶血作用，在所研究的光谱区域中，也不显著改变红外光谱。
在进一步的试验中，通过在普通盐水溶液中轻轻抖动刷子，来获得用这刷子所得到的被剥离的刮屑物上的细胞。通过离心将这细胞悬浮液的两半分别作成丸。去除上层清液后，将一个丸冻在液氮中，以备以后按照本发明用光谱学方法作IR吸收研究，而将另一等分试样丸在显微镜载物片上，用Papanicolaou染剂染色并固定，并用通常方法诊断。每个样品由两个有经验的内科医生评价，而且这些评价完全一致。如前面图1所说明的那样得到红外吸收光谱。将细胞涂抹在上述样品支架上，在施加样品后，光谱图样稳定许多小时。使一自动比例绘图装置自动归一化峰强度。
将试验分为两组，这两组是ⅰ)大气压强试验，这里发现由1990年12月25日公开的美国专利4，980，551所说明并要求保护样品支架是有用的，以及ⅱ)高压试验，这里发现1990年11月13日公开的美国专利4，970，396所说明并要求保护的样品支架是有用的。
在通常的细胞学评价的基础上被评定为正常健康样品的那些子宫颈样品基本显示了相同的IR光谱。用细胞学方法被诊断为恶性的那些样品的光谱，与正常样品的光谱是明显不同的。图2中，对于正常的健康的子宫颈组织的结果显示为一一一，而对于恶性子宫颈组织的结果显示为-，这些是来自正常的健康的及恶性的子宫颈样品的典型光谱。最突出的差别包括在那些恶性样品中的下述研究结果a)在～1025cm-1、～1047cm-1(在～1025cm-1波带上呈现一个肩形凸出部)、～1082cm-1、～1155cm-1、～1244cm-1及～1303cm-1各波带处的强度剧烈变化，b)～1082cm-1、～1155cm-1及～1244cm-1峰的显著位移，以及c)在970cm-1处的一个新波带峰。
在图3到图5中，○是对于正常的健康的被剥离的子宫颈组织的结果，而●是对于恶性的被剥离的子宫颈组织细胞的结果。图3和图4显示了在～1082cm-1及～1155cm-1处的两个峰中的位移各自平均约为4及12个波数，这是对于所有被研究的样品。图5显示了在正常和癌组织样品之间、在～1025cm-1及～1082cm-1波带之间的峰强度比。
发现～1025cm-1及～1047cm-1处的波带是由于碳水化合物产生，并发现糖原对这些波带的强度作出了压倒性贡献。发现～1082cm-1及1244cm-1处的波带，分别是由于对称及反对称磷酸盐(PO-2)延伸模式产生。发现它们主要起源于细胞核酸的磷酸二酯的振动。发现～1155处的波带是由于除了其它的东西外还有细胞蛋白质中氨基酸的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的残基的C-OH基以及碳水化合物的C-OH基的C-O延伸模式产生。在～1303cm-1处的波带由许多重迭波带构成，而且业已确定了它的分配。最后，发现在970cm-1处的波带部分是由于一些双阴离子磷酸盐基的振动模式产生，如在典型的磷酸化蛋白质的红外光谱中先前已观察到的那样，而且部分还由于DNA和/或RNA分子。
现在参考图6，这是一幅图2的一部分的放大图，且对应于图7所示的三次幂所派生的图，反对称磷酸盐伸展波带的更详细的研究展示了，在用-显示的恶性被剥离的子宫颈组织中，它由两个重迭的波带构成，其中一个低频波带当与正常的健康的被剥离的细胞比较时显著增加。当PO-2基完全被氢键合时，在进行上述试验时，已知反对称PO-2伸展波带的频率是～1220cm-1，当它未被氢键合时，大于～1240cm-1。这一发现表明，与正常的被剥离的子宫颈组织的情况相对照，在子宫颈癌中，许多核酸的PO-2基被氢键合。这个结论进一步被这些波带的频率对于压力的依赖性所支持，如图8所示，这里○表示对于正常的健康的被剥离的子宫颈组织的结果，而●表示对于患癌的被剥离的子宫颈组织的结果。发现低频波带的频率随压力增加而减少，而发现癌的高频波带的频率及正常的健康组织的单个PO-2波带随压力增加而增加。已知上述低频波带对压力的这种反应是典型的被氢键合的基，因为压力增强了氢键合的强度，因此而减少了上述PO-2延伸的频率。另一方面，已知对于恶性及正常组织两者共同的上述压力对高频PO-2波带的影响是非氢键合的功能团的特征，而且是来源于压力增强了分子间的相互作用。
图9和图10显示了在1155cm-1处的C-O延伸波带的类似分析，这里对于正常的健康的被剥离的子宫颈组织的细胞的结果显示为---，而对于患癌的被剥离的子宫颈组织的细胞的结果显示为-，这分析显示了它由～1153cm-1、～1161cm-1及～1172cm-1三个重迭波带构成，当与正常的子宫颈组织的相应波带比较时，前两个显示了强度减少，而第三个强度增加。头两个的频率随压力增加而减少，而发现后者的频率如图11所示增加。因此，这些发现表明，在～1153cm-1及～1161cm-1处的组分波带产生于被氢键合的C-OH基的延伸振动，而在～1172cm-1处的波带是由于未被氢键合的C-OH基的延伸振动。
图12中，○表示对于正常的健康的被剥离的子宫颈组织的细胞的结果，而●表示对于患癌的被剥离的子宫颈组织的细胞的结果，在1466cm-1到1476cm-1的频率范围中显示了酯类的亚甲基链的CH2弯曲模式的频率对压力的依赖性。这个波带的频率对压力的依赖性，先前已被广泛用来研究酯类双层的链与链之间的紧束及有序/无序性质。已发现在酯类双层压力中，这个波带的频率要产生一个增量，这是因为出现了上述亚甲基链的被诱导的形态与取向有序，由此这一点增加了链与链之间的相互作用。在恶性子宫颈组织中，与正常健康组织相比，发现压力在这个频率范围诱导了一较小的位移。这表明，在被剥离的子宫颈癌组织的细胞中，比在正常健康的被剥离的子宫颈组织的细胞中，酯类的亚甲基链更无序。
图13中，---表示对于正常健康的被剥离的子宫颈样品的结果，对于发育异常的结果表示为-·-·，而对于恶性样品的结果表示为-。
图13中，与正常样品相比，发育异常样品的显著差别包括a)～1025cm-1、～1082cm-1、～1244cm-1及1303cm-1这些波带的强度中的剧烈变化，以及b)在～1047cm-1及～1082cm-1波带的频率中的显著位移。
还是在图13中，与正常及发育异常样品相比，对于恶性样品的显著差别包括a)在～970cm-1、～1025cm-1、～1047cm-1、～1082cm-1、～1155cm-1、～1244cm-1及～1303cm-1这些波带的强度中的剧烈变化，以及b)在～1025cm-1、～1047cm-1、～1082cm-1及～1155cm-1这些波带的频率中的显著位移。
这些试验表明，伴随子宫颈被剥离的癌组织，有几个重要变化。与正常健康的被剥离的子宫颈组织的细胞相比，在被剥离的子宫颈癌组织的细胞中，发现糖原的量引人注目地减少。这点进一步被下述事实所证实，这事实是，肝癌(肝是一个糖原极丰富的器官)显示了一类似的光谱图样，在结肠癌中未观察到这光谱图样，结肠是糖原贪乏的肠部分。
可将糖原(来自哺乳动物肝的D-糖原)的已知光谱，与申请人在～975至1100cm-1频率范围中得到的光谱进行比较(图13和14)。
进一步，在被剥离的子宫颈癌组织的细胞中，发现核酸的磷酸二酯基的氢键合有所增加。这一光谱研究结果与其它一些试验中的那些发现是共同的，这些其它试验用了经过癌组织活组织检查的一些样品，申请人已检查了这些样品，例如这些样品是结肠、肝、皮肤、阴道及乳房的样品。
图14中，对于健康的阴道样品的结果显示为---，而对于恶性样品的结果显示为-。
图14中，与正常样品相比，对于恶性样品的显著差别包括a)在～1025cm-1、～1154cm-1、～1240cm-1及～1300cm-1这些波带处的强度中的剧烈变化，以及b)在～1025cm-1、～1155cm-1及～1081cm-1这些波带的频率中的显著位移。
这些和其它一些试验表明，本发明是有用的，例如对于检测来自各种人类或其它哺乳动物器官或组织的分泌物、渗出物、漏出物的被剥离的组织或细胞样品中的异常是有用的，特别是对于检测来自Papanicolaou子宫颈涂片的被剥离的癌组织或细胞是有用的，所述Papanicolaou子宫颈涂片也就是子宫颈内涂片、子宫颈外涂片、阴道涂片及子宫涂片。
根据本发明可检测的被剥离的细胞的异常包括例如病毒、细菌、真菌及其一些传染及非传染疾病。
可以检测被剥离的细胞中或被剥离的组织里细胞中的细胞异常。
权利要求
1.一种用红外光谱仪检测被剥离的细胞中存在异常的方法包括a)将一束红外光照射被剥离的细胞的一个样品，以及b)通过上述样品的红外吸收的光谱分析确定该样品中是否存在异常，这分析是在至少一个频率范围，以确定是否已出现上述红外吸收特性中的至少一种变化，这变化是由于存在于上述样品中的至少一种分子功能团的振动而出现，所述样品表片了那种异常。
2.如权利要求1所述的一种方法，其中所述那些红外吸收特性中的至少一种变化是在某一特定频率处的吸收强度变化、出现一特定吸收时的频率变化或施加到所述功能团上的不同压力引起的频率变化，在此频率出现了某一特定吸收。
3.如权利要求1所述的一种方法，其中上述分子的功能团是下列分子中的至少一种碳水化合物、核酸、组织蛋白质或膜脂类。
4.如权利要求1所述的一种方法，其中上述功能团是核酸中的一磷酸二酯基、组织蛋白质及碳水化合物中的-C-OH基或酯类中的-CH2基。
5.如权利要求1所述的一种方法，其中上述分子功能团是下列物质中的至少一种一些碳水化合物、一些核酸中的一些磷酸二酯基、一些组织蛋白质和碳水化合物的一些C-OH基或一些酯类的CH2基。
6.如权利要求1所述的一种方法，其中上述样品是Papanicolau涂片。
7.如权利要求1所述的一种方法，其中上述样品是一子宫颈样品。
8.如权利要求1所述的一种方法，其中上述样品是一子宫内样品。
9.如权利要求1所述的一种方法，其中上述样品是一子宫外样品。
10.如权利要求1所述的一种方法，其中上述样品是一阴道样品。
11.如权利要求1所述的一种方法，其中上述样品是一子宫样品。
全文摘要
用红外光谱检测被剥离的细胞中存在异常。将一束红外光照射到包含细胞的样品上，所述细胞可以是各种器官或组织的被剥离的细胞的分泌物、渗出物、漏出物、刮屑物、刷下来东西或用其它方式得到的群体，并通过确定已出现红外吸收中的变化，在至少一个频率范围检测上述异常，所述红外吸收中的变化是由于功能团的振动产生，这振动例如是核酸的磷酸二酯基的振动、组织蛋白质的COH基的振动、碳水化合物的振动，所述红外吸收的变化或者是由于酯类分子的特殊排列或存在于所述样品中的异常酯类结构而产生。
文档编号G01N33/487GK1067314SQ9210143
公开日1992年12月23日 申请日期1992年2月4日 优先权日1991年2月4日
发明者帕特里克·T·T·王, 巴斯尔·里家斯 申请人:加拿大国家研究会