一种动员骨髓造血干细胞的新型制剂的制作方法
【专利摘要】本发明现提供一种动员骨髓造血干细胞的新型制剂，包括DFO，DFO的剂量范围为1?15mg/kg。优选DFO和BOP联合使用。本发明具有2个显著性优势，第一，动员周期短，仅需要1小时至数小时便可高效收集供者骨髓干细胞，第二，与传统方法相比，该方法无副作用，不会诱导血液细胞肿瘤等不良反应。
【专利说明】
一种动员骨髓造血干细胞的新型制剂
技术领域
[0001] 本发明生物技术领域，具体涉及一种动员骨髓造血干细胞的新型制剂。
【背景技术】
[0002] 造血干细胞是指尚未发育成熟的细胞，是所有血细胞和免疫细胞的起源，它不仅 可以分化为红细胞、白细胞和血小板，还可跨系统分化为各种组织细胞，因此是多功能干细 胞，医学上称其为"万用细胞"，也是人体的始祖细胞。
[0003] 骨髓是存在于长骨（如肱骨、股骨）的骨髓腔和扁平骨（如髂骨）的稀松骨质 间的网眼中，是一种海绵状的组织，能产生血细胞的骨髓略呈红色，称为红骨髓。人出生时， 红骨髓充满全身骨髓腔，随着年龄增大，脂肪细胞增多，相当部分红骨髓被黄骨髓取代，最 后几乎只有扁平骨骨髓腔中有红骨髓。此种变化可能是由于成人不需全部骨髓腔造血，部 分骨髓腔造血已足够补充所需血细胞。当机体严重缺血时，部分黄骨髓可被红骨髓替代，骨 髓的造血能力显著提高。
[0004] 造血干细胞有两个重要特征:其一，高度的自我更新或自我复制能力；其二，可分 化成所有类型的血细胞。造血干细胞采用不对称的分裂方式：由一个细胞分裂为两个细胞。 其中一个细胞仍然保持干细胞的一切生物特性，从而保持身体内干细胞数量相对稳定，这 就是干细胞自我更新。而另一个则进一步增殖分化为各类血细胞、前体细胞和成熟血细胞， 释放到外周血中，执行各自任务，直至衰老死亡，这一过程是不停地进行着的。
[0005] 近30年来，血细胞生成的研究发展很快，现已证明人类骨髓中存在造血多能干细 胞，数量不到骨髓总细胞数的百分之一，它们具有高度自我更新的能力;并且能分化为各血 细胞系统的祖细胞(如淋巴系干细胞、粒系干细胞），在大量分化，增殖为各种原始和成熟血 细胞，最后，这些成熟的血细胞通过骨髓进入血液中，发挥各自的生理作用。人体造血干细 胞由于存在的部位不同，产生不同效能。一部分存在于干细胞池，是人体造血细胞再生的储 备库，以适应和满足各种状态下造血的需要:另一部分存在于增殖池，这些细胞不断增殖更 新，以弥补因细胞衰老或丢失所致的血细胞不足，维持人体血流平衡。
[0006] 大部分白血病，特别是急性髄系白血病(AML)以及慢性髄性白血病（CML)的发生， 都直接或间接与造血干细胞异常相关。CML是最经典染色体易位导致造血干细胞恶变的一 类常见白血病，其他多数急性髓系白血病由祖细胞直接恶变而来。造血干细胞最先获得染 色体易位等主要的致病突变，但并不影响其分化为正常功能的成熟细胞的能力，当染色体 易位的造血干细胞或者其分化下游的细胞获得第二次打击之后，就会引发白血病。
[0007] 虽然根据文献报道和我们前期研究结果可知人类细胞集类刺激因子G-CSF在造血 干细胞刺激中起关键作用，但是目前尚缺少一种有效的G-CSF动员制剂，仍缺乏可行的造血 干细胞动员方法。
[0008] 中国专利申请201310057178.5-种动员造血干细胞的制剂及其分离方法，采用了 CoCl2和AMD3100动员骨髓间充质干细胞，但没有对动员骨髓造血干细胞动员的制剂或方 法。
【发明内容】
[0009]本发明的目的主要是针对现有技术中的问题，现提供一种动员骨髓造血干细胞的 制剂及其分离收集造血干细胞方法。
[0010]为实现本发明的目的，本发明提供了以下技术方案： 一种动员骨髓造血干细胞的新型制剂，所述动员骨髓造血干细胞的制剂包括DFO。 [0011] 所述DFO的剂量范围为l-10mg/kg。
[0012] 所述DFO和BOP联合使用。
[0013] 所述DFO和AMD3100联合使用。
[0014] 所述 AMD3100 的剂量为 l-4mg/kg。
[0015] 所述DFO和AMD3100以及BOP联合使用。
[0016]所述 BOP 的剂量为 l-15mg/kg。
[0017] 所述DF0、AMD3100以及BOP的剂量比为：卜3:1:卜4。
[0018] -种利用动员骨髓造血干细胞的制剂分离并收集造血干细胞的方法，利用所述的 制剂促使造血干细胞动员进入外周血然后进行分离。
[0019] 分离和收集造血干细胞的步骤如下：采取外周血，用淋巴细胞分离液分离单个核 细胞，用含有5-30%胎牛血清的DMEM培养基重悬，接种至培养瓶，培养3-8天后换液，第9-15 天得到外周血造血干细胞。
[0020] 本发明的优点在于： 1、 经过试验证明，本发明的动员骨髓造血干细胞的制剂动员周期短，仅需要1小时至数 小时便可高效收集供者骨髓干细胞； 2、 与传统方法相比，该方法无副作用，不会诱导血液细胞肿瘤等不良反应。
【具体实施方式】
[0021] 为了更详细地说明本发明，给出下述制备实例。但本发明的范围并不局限于此。 [0022] 将DFO粉末用生理盐水配成浓度为10mg/ml的溶液，AMD3100用生理盐水配成Img/ ml的溶液，BOP晶体用生理盐水配制浓度为I Omg/ml的溶液。然后用生理盐水配制不同溶液， 其中所有分组都是以大鼠为实验对象， DFO动员组:每天给予大鼠腹腔注射DFO溶液10mg/kg; DFO联合AMD3100动员组:先给予DFO 10mg/kg/d*7d，第8天腹腔注射AMD3100 5mg/kg; DFO 联合 BOP 动员组:每天给予 DF010mg/kg/d*7d 和 B0F10mg/kg/d*7d; DFO 联合 BOP 以及AMD3100 动员组：先给予DF010mg/kg/d*7d 和B0F10mg/kg/d*7d，第 8天 腹腔注射AMD3100 5mg/kg; 采集各组大鼠外周血，采用成纤维样细胞集落形成培养法(CFU-F法)检测各组外周血 HSCs的数量，证实DFO、DFO联合AMD3100以及DFO联合BOP对HSCs的动员作用。
[0023] 实施例1 1.试剂配制 DF0:称取IOOmgDFO粉末，加 IOml生理盐水，配成10mg/ml的储存液，0.22μπι滤器过滤后 分装，-20°C保存。动物给药时将储存液用生理盐水稀释10倍将浓度调至4mg/ml。首先配制 3mg/ml的DFO溶液，然后配制2mg/ml DFO和2mg/ml BOP的混合溶液。
[0024] (2)AMD3100: 5g粉剂加5ml生理盐水，配成lmg/ml的溶液，0 · 22μπι滤器过滤分装，- 20°C保存。生理盐水稀释4倍至1.25mg/ml用于小鼠给药。
[0025] 2.动物分组 (1)为检测DFO及DFO联合AMD3100对HSCs的动员作用，将大鼠分为6组，每组5只，分别 为:①生理盐水组即NS组:每天给予大鼠腹腔注射生理盐水(与DFO同体积），共7天;②DF07d 组:每天给予腹腔注射DFO溶液10mg/kg，共7天;③AMD3100组:第1-7天给予相应体积生理盐 水，第8天腹腔注射AMD3100 5mg/kg，l小时后准时采集外周血;④DFO联合AMD3100组:先给 予DFO 10mg/kg/d*7d，第8天腹腔注射AMD3100 5mg/kg;⑤DFO联合BOP组：每天给予DFO和 BOP分别 5mg/kg/d;⑥ DF0、B0P联合AMD3100 组：先给予DFO和BOP分别 5mg/kg/d*7d，第8 天腹 腔注射AMD3100 5mg/kg; 1小时后准时采集外周血。
[0026] 3.大鼠外周血细胞提取 各处理组到达相应处理时间后，分别取外周血单个核细胞进行CFU-F法检测HSCs数量。
[0027] 4.CFU-F法 将6ml外周血中所含MNCs用5ml含有20%FBS、1%青链霉素的LG-DMEM培养基重悬，接种于 底面积为12.5cm2的塑料培养瓶中，置于37°C含5%C02孵箱培养。培养7天后换液，倒置显微镜 下观察，于第10天时计数外周血CFU-Es。将呈成纤维细胞样形态、生长密集、>50个细胞的集 落记为CFU-F。
[0028] 一个HSCs贴壁即扩增形成一个CFU-F，基于此理论，CFU-F培养法己成为检测外周 血HSCs数量的经典方法。CFU-F法检测结果发现:给予DF010mg/kg/d*7d，大鼠外周血CFU-Fs 数量较对照组显著增加。与生理盐水对照组相比，AMD3100组外周血中CFU-Fs数量并无明显 增加。与单用DFO组相比，DFO联合AMD3100可以显著增加 HSCs动员效率。本申请者研究发现： DF010mg/kg给予7天可增加大鼠外周血HSCs的数量。DFO联合CXCR4抑制剂AMD3100可以增加 HSCs动员效率。
[0029] 通过以上表格可以看出，AMD3100组外周血中CFU-Fs数量并无明显增加。与单用 DFO组相比，DFO联合AMD3100可以显著增加 HSCs动员效率。其中动AMD3100组外周血中CFU-Fs数量并无明显增加。与单用DFO组相比，DF0、B0P联合AMD3100组动员效果最好。
[0030]以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此， 任何熟悉本领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应 涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。
【主权项】
1. 一种动员骨髓造血干细胞的新型制剂，其特征在于：所述动员骨髓造血干细胞的制 剂包括DFO。2. 根据权利要求1所述的动员骨髓造血干细胞的新型制剂，其特征在于:所述DFO的剂 量范围为l-l〇mg/kg。3. 根据权利要求1所述的动员骨髓造血干细胞的新型制剂，其特征在于:所述DFO和BOP 联合使用。4. 根据权利要求1所述的动员骨髓造血干细胞的新型制剂，其特征在于：所述DF0和 AMD3100联合使用。5. 根据权利要求4所述的动员骨髓造血干细胞的新型制剂，其特征在于:所述AMD3100 的剂量为l-4mg/kg。6. 根据权利要求4所述的动员骨髓造血干细胞的新型制剂，其特征在于：所述DFO和 AMD3100以及B0P联合使用。7. 根据权利要求3或6任一项所述的动员骨髓造血干细胞的新型制剂，其特征在于:所 述B0P的剂量为l_15mg/kg。8. 根据权利要求7所述的动员骨髓造血干细胞的新型制剂，其特征在于：所述DF0、 AMD3100以及B0P的剂量比为：1-3:1:1-4。9. 一种利用权利要求1-8任一项所述的新型制剂分离并收集造血干细胞的方法，其特 征在于:利用所述的制剂促使造血干细胞动员进入外周血然后进行分离。10. 根据权利要求9所述的分离并收集造血干细胞的方法，其特征在于:分离和收集造 血干细胞的步骤如下:采取外周血，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，用含有5-30%胎牛 血清的DMEM培养基重悬，接种至培养瓶，培养3-8天后换液，第9-15天得到外周血造血干细 胞。
【文档编号】C12N5/0789GK105861440SQ201610323290
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月17日
【发明人】李相鲁, 张严冬, 谢海涛
【申请人】广东万海细胞生物科技有限公司