专利名称：一种脐带血分离二联袋分离造血干细胞的方法
技术领域：
本发明涉及一种分离干细胞的方法，尤其是一种利用脐带血分离二联袋分离造血干细胞的方法。
背景技术：
干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。随着干细胞研究的不断深入，其临床应用的范围也不断扩大，造血干细胞是临床上应用最早的干细胞，是体内各种血细胞的唯一来源，它主要存在于骨髓、外周血、脐带血中。造血干细胞的移植是治疗血液系统疾病、免疫系统疾病、先天性遗传疾病以及多发性和转移性恶性肿瘤疾病的有效方法。脐带血因其采集容易、来源广泛、免疫原性低等特点成为造血干细胞的重要来源， 脐带血造血干细胞储存成为了满足临床使用的有效手段。脐带血造血干细胞储存的核心技术之一是脐带血的分离，是经过一系列的处理方法将脐带血中的红细胞和多余血浆去除， 有效的浓缩储存体积并尽可能的提高造血干细胞的回收率。在这个过程中，需要注意的是 1、有效的分离，既要保证能够浓缩血液体积，又不会造成造血干细胞的丢失，还要保证浓缩的血液中无小块凝血；2、严格的无菌操作，脐血样本十分的珍贵，一个孩子一生只有一次， 一旦细胞被污染，会造成当事人无法接受治疗或者治疗的难度加大；3、过于复杂的装置不仅给操作带来麻烦，也不利于分离出细胞的质量和降低污染，同时精简结构又不能够牺牲其实用性。目前用于造血干细胞的转移、分离的容器相关产品主要是三联袋、开放性分离袋及采集多联袋，开放性分离袋在操作的过程中需要多次与其他容器连接，所有连接过程均需要在无菌的环境下操作，容易造成污染；采集多联袋主要是用于普通的采血，不适用于脐带血的分离；而三联袋是由三个大小不同的袋子封闭连接，通过将脐带血分离出的干细胞加入冻存液后至冻存袋中封闭后冻存，但三联袋通常仅能满足基本的分离转移功能，针对分离过程中的细节，如何去除小的凝血如何保证分离中添加的溶液无菌，确保分离无菌得不到保证，同样存在受污染的风险。
发明内容
为了解决现有技术中造血干细胞的转移、分离的开放式操作易受污染等不足，本发明提供一种脐带血分离二联袋分离造血干细胞的方法，该方法密闭操作，安全有效，无污染。本发明采取的技术方案是一种脐带血分离二联袋分离造血干细胞的方法，包括 200ml主袋、150ml转移袋，所述主袋上连通有进料管、转移接管，进料管上设有进料控制阀和0. 22um过滤器，转移接管上连通有并联的进血管和转移管，进血管上设有进血控制阀和血液过滤网，转移管上连通转移袋，且转移管上还设有转移控制阀，转移接管上还设有取样口，所述主袋上还设有外接细胞冷冻袋的细胞排出口，所述分离造血干细胞的方法包括以下步骤(a)将脐带血采集袋中的血液混勻后经带血液过滤网的进血管转移至200ml主袋中， 转移后将进血控制阀关闭；
(b)从进料管加入采集血量1/5体积的羟乙基淀粉HES至主袋中，转移后将进料控制阀关闭；
(c)将脐带血和羟乙基淀粉HES混勻，将脐带血分离二联袋整体至离心机中使主袋接口朝下，以400转/分钟的转速离心7分钟；
(d)将离心后置于主袋最下层的红细胞(约为脐带血总体积的1/5)通过转移接管和转移管转移至150ml转移袋中，转移后将转移控制阀关闭；
(e)将主袋所剩的血液成分重新混勻，将脐带血分离二联袋整体至离心机中使主袋接口朝上，以1500转/分钟的转速离心15分钟；
(f)打开转移控制阀，通过血液分浆夹将离心后置于主袋上层的2/3血浆经转移接管和转移管转移至150ml转移袋中；
(g)混勻主袋中余下的富含造血干细胞的浓缩血，从转移接管上的取样口取Iml的样品，计算有核细胞总数、细胞活率，检测细胞集落形成能力和CD34+细胞占有核细胞的百分比；
(h)通过带0.22um过滤器的进料管加入浓缩血1/4体积的4°C预冷的细胞冷冻保护液，混勻，冷冻保护液的成分为DMS0、右旋糖酐，二者体积比为1:1 ；
(i)混勻后立即将细胞排出口上接细胞冷冻袋，将上述步骤主袋中的由细胞冷冻保护液保护的浓缩血全部转移至细胞冷冻袋中；
(j)将细胞冷冻袋接口封口后，从脐带血分离二联袋上分离，放入程控降温仪中缓慢降温至-80°C后置入液氮罐中长期保存；
(k)将转移袋中的混合血液成分混勻后转移回至主袋中，通过主袋上的取样口取30ml 留样，取20ml做细菌检测和病原微生物的检测。采用以上技术方案，本发明的有益效果是
1、采用血液过滤网，避免血液凝集物造成造血干细胞分离不彻底，影响储存和将来使
用；
2、采用0.22um过滤器保证了分离过程中添加溶液无菌，降低细胞污染概率；
3、由多处控制阀确保分离袋在分离过程中完全密闭，不受污染，安全性能高；
4、主袋上的转移接管处于正中，方便血液成分转移至200ml主袋，也方便血液成分从 200ml主袋转移至150ml转移袋，细胞排出口在主袋上的边缘易于操作，同时也能减少造血干细胞的丢失；
5、分离二联袋的各部件封闭连接，易于操作，节省操作时间，降低污染。本发明的二联袋采用离心的方法实现造血干细胞的分离，采用的二联袋结构简单实用，整体分离工艺简便，全密闭的分离，能安全有效地浓缩造血干细胞的储存体积，并尽可能的提高造血干细胞的回收率。5份脐带血样本经此二联袋分离后的结果如下
权利要求
1.一种脐带血分离二联袋分离造血干细胞的方法，包括200ml主袋(1)、150ml转移袋 O)，所述主袋上连通有进料管(7)、转移接管(3)，进料管上设有进料控制阀(10)和0. 22um 过滤器(11)，转移接管上连通有并联的进血管(6)和转移管(5)，进血管上设有进血控制阀 (9)和血液过滤网(13)，转移管上连通转移袋O)，且转移管上还设有转移控制阀(8)，转移接管上还设有取样口(12)，所述主袋上还设有外接细胞冷冻袋的细胞排出口 0)，其特征在于分离造血干细胞的方法包括以下步骤(a)将脐带血采集袋中的血液混勻后经带血液过滤网的进血管转移至200ml主袋中， 转移后将进血控制阀关闭；(b)从进料管加入采集血量1/5体积的羟乙基淀粉HES至主袋中，转移后将进料控制阀关闭；(c)将脐带血和羟乙基淀粉HES混勻，将脐带血分离二联袋整体至离心机中使主袋接口朝下，以400转/分钟的转速离心7分钟；(d)将离心后置于主袋最下层的红细胞通过转移接管和转移管转移至150ml转移袋中，转移后将转移控制阀关闭；(e)将主袋所剩的血液成分重新混勻，将脐带血分离二联袋整体至离心机中使主袋接口朝上，以1500转/分钟的转速离心15分钟；(f)打开转移控制阀，通过血液分浆夹将离心后置于主袋上层的2/3血浆经转移接管和转移管转移至150ml转移袋中；(g)混勻主袋中余下的富含造血干细胞的浓缩血，从转移接管上的取样口取Iml的样品，计算有核细胞总数、细胞活率，检测细胞集落形成能力和CD34+细胞占有核细胞的百分比；(h)通过带0.22um过滤器的进料管加入浓缩血1/4体积的4°C预冷的细胞冷冻保护液，混勻；(i)混勻后立即将细胞排出口上接细胞冷冻袋，将上述步骤主袋中的由细胞冷冻保护液保护的浓缩血全部转移至细胞冷冻袋中；(j)将细胞冷冻袋接口封口后，从脐带血分离二联袋上分离，放入程控降温仪中缓慢降温至-80°C后置入液氮罐中长期保存；(k)将转移袋中的混合血液成分混勻后转移回至主袋中，通过主袋上的取样口取30ml 留样，取20ml做细菌检测和病原微生物的检测。
2.根据权利要求1所述的一种脐带血分离二联袋分离造血干细胞的方法，其特征在于所述细胞冷冻保护液的成分为DMS0、右旋糖酐，二者体积比为1:1。
全文摘要
本发明涉及一种脐带血分离二联袋分离造血干细胞的方法，采用主袋、转移袋分步分离红细胞和血浆至转移袋，添加冷冻保护液将细胞转移至细胞冷冻袋并最终冷冻储存。本方法采用离心的方法实现造血干细胞的分离，采用的分离转移袋结构简单实用，整体分离工艺简便，全密闭的分离，降低污染，能安全有效地浓缩造血干细胞的储存体积，并尽可能的提高造血干细胞的回收率。
文档编号C12N5/0789GK102337245SQ201110219408
公开日2012年2月1日 申请日期2011年8月2日 优先权日2011年8月2日
发明者宋云庆, 李俊, 李晓鸣, 杨兵, 陈林 申请人:江苏省北科生物科技有限公司