专利名称：：脐血单个核细胞体外扩增并保持造血细胞植入能力的方法
技术领域：
：本发明涉及细胞培养扩增的方法，特别涉及脐血单个核细胞体外扩增并保持造血细胞植入能力的方法。
背景技术：
：造血干细胞的移植是血液学领域的重要技术，其己成为治愈某些恶性血液病、实体瘤、遗传性及免疫性疾病的可靠选择。人们早就认识到脐血中含有大量的造血干/祖细胞，但是单份脐血所含造血干/祖细胞的数量少,难以满足成年人及较大体重患者的需要,而且脐血移植后造血细胞恢复时间迟，限制了其在临床上的应用。为了提高脐血造血细胞在临床上的利用率，对脐血造血细胞进行体外扩增成为了必然手段之一。目前国内外学者多采用含不同细胞因子组合的培养体系对脐血造血细胞进行体外扩增，但单利用细胞因子对脐血造血细胞进行体外扩增，在获得大量造血早期细胞的同时，不可避免地造成造血干细胞的过度分化，使具归巢和长期植入能力的干细胞数目减少。另有一些研究表明，造血细胞的生长发育离不开造血微环境的作用,其中骨髓基质细胞是造血微环境的重要组成部分。基质系统的存在可以改善扩增的效果，单用骨髓基质细胞支持能较好地维持造血干/祖细胞数目，但不能使造血细胞数量得到显著性扩增，难以满足动物实验及临床需要。
发明内容本发明的目的是提供一种脐血单个核细胞体外扩增并保持造血细胞植入能力的方法，其不仅能使脐血造血细胞数量得到显著性扩增，而且可以避免在扩增过程中造血干细胞的过度分化，在大量扩增脐血造血早期细胞的同时维持一定量具长期植入能力的造血干细胞。为了实现上述目的，本发明提供一种脐血单个核细胞体外扩增并保持造血细胞植入能力的方法，其包括以下步骤(1)取骨髓液，分离出单个核细胞，用培养液培养出骨髓基质细胞；(2)步骤(1)培养的基质细胞层融合后，经15Gy60Co照射，洗涤；(3)将经步骤(2)后基质细胞加入无血清培养液中；(4)往上步骤后的培养体系中加入外源性细胞因子，建立造血细胞培养体系；(5)从脐血中分离出单个核细胞，种植到步骤(4)建立的造血细胞培养体系中进行培养扩增。本发明提供的脐血单个核细胞体外扩增并保持造血细胞植入能力的方法，其结合了基质细胞及细胞因子，运用上述科学的方法及合理的步骤将两者联合到脐血单个核细胞的扩增中来，充分利用基质系统和细胞因子的优点。该方法不仅能使脐血造血细胞数量得到显著性扩增，而且可以避免在扩增过程中造血干细胞的过度分化，在大量扩增脐血造血早期细胞的同时维持一定量具长期植入能力的造血干细胞。具体实施例方式本发明提供的脐血单个核细胞体外扩增并保持造血细胞植入能力的方法，其包括以下步骤(1)取骨髓液，分离出单个核细胞，用培养液培养出骨髓基质细胞；(2)步骤(1)培养的基质细胞层融合后，经15Gy60Co照射，洗涤；(3)将经步骤(2)后基质细胞加入无血清培养液中；(4)往上步骤后的培养体系中加入外源性细胞因子，建立造血细胞培养体系；(5)从脐血中分离出单个核细胞，种植到步骤(4)建立的造血细胞培养体系中进行培养扩增。本发明的具体步骤为用IMDM培养液(培养体系含15%FBS)培养人骨髓基质细胞，培养7-14天基质细胞层融合(约80%)后，经15Gy"'Co照射后，洗涤3次后加入StemspanTm无血清培养液(Stemcell公司产品)，然后往培养体系中加入细胞因子SCF、FL及TP0(细胞因子浓度均为40ng/ml)，建立新的造血细胞培养体系备用。从脐血中分离出单个核细胞，种植到上述含人骨髓基质细胞支持的6ml无血清培养体系中，种入25cm2培养瓶，置37"C，体积分数为5%的0)2全湿培养箱中培养。本发明提供的脐血单个核细胞体外扩增并保持造血细胞植入能力的方法，其结合了基质细胞及细胞因子，运用上述科学的方法及合理的步骤将两者联合到脐血单个核细胞的扩增中來，充分利用基质系统和细胞因子的优点。该方法不仅能使脐血造血细胞数量得到显著性扩增，而且可以避免在扩增过程中造血干细胞的过度分化，在大量扩增脐血造血早期细胞的同时维持一定量具长期植入能力的造血干细胞。本发明方法的效果，可以通过以下三种测试和验证手段进一步说明-1、脐血单个核细胞的体外扩增效果从脐血分离出MNC，然后按本扩增体系进行扩增，在第6天进行取样，并进行细胞计数，用流式细胞仪对细胞表面CD34+，CD34+CD49d+，CD34+CXCR4+标志进行检测，用PBS洗涤细胞2次后配成2X107ml浓度，以100ul细胞悬液20ul单克隆抗体的比例充分混匀后置于4"C避光孵育30分钟，再用PBS洗涤3次后用流式细胞仪分别检测CD34+细胞数，同时检测CD34+细胞上VLA-4及CXCR4的表达情况。CD34+细胞、CD34+CD49d+细胞及CD34+CXCR4+细胞的扩增结果分别参见表1、表2和表3(A组为单用人骨髓基质细胞支持进行扩增组；B组为单用细胞因子支持扩增组；C组为本发明的人骨髓基质细胞联合细胞因子支持扩增组)表l三种不同培养体系作用下脐血CD34+细胞的扩增情况(X±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表2三种不同培养体系作用下脐血0034+CXCR4+细胞的扩增情况(X土s)组别起始CD34+CXCR4+细胞数(X扩增后细胞数(X扩增倍数107ml)107ml)A0.83±0.242.63±1.043.29±1.08B0.83±0.240.96±0.281.17±0.11C0.83±0.244.41±1.085.56±1.14表3三种不同培养体系作用下脐血0034+VLA-4+细胞的扩增情况(X土s)组别起始CD34+VLA-4+细胞数(X扩增后细胞数(X扩增倍数107ml)107ml)A0.97±0.523.13±1.873.20±0.82B0.97±0.522.42±1.182.62±0.38C0.97±0.526.02±1.786.36±0.942、造血干/祖细胞总集落扩增分析在第6天进行造血细胞集落培养，半固体培养基为MethoCUltTMGF(H4434)(Stemcell公司)，取出各组细胞用PBS洗涤2次后配成5X107ml的浓度备用。将0.9ml培养基小心加到35mm的培养板，再加入0.lml的上述细胞悬液，即配成5X107ml的浓度，充分振荡，使细胞和培养基混匀，于上述培养条件中培养,第14天倒置显微镜下计数集落形成单位数(CFU)，显微镜下以含50个细胞以上的细胞团为一个集落。于第14天倒置显微镜下计数CFU。用人骨髓基质细胞联合细胞因子的无血清共培养体系中，脐血单个核细胞集落形成单位数较单用细胞因子或人骨髓基质细胞组要多(P<0.05)(见表4)。表表4三种不同培养体系作用下脐血集落形成单位的扩增情况(X土s)组别起始CFU数(/1()5个丽C)扩增后CFU(/105个扩增倍数MNC)A196.20±79.741757.80±823.049.00±1.54B196.20±79.74830.10±277.454.64±1.26C196.20±79.742067.60±850.3410.81±1.373、人脐血细胞移植NOD/SCID小鼠体内N0D/SCID小鼠，雌雄不限，6-8周龄，无特定病原体条件下饲养。移植前250cGyX线加速器亚致死量照射(剂量率220cGy/min)，照射后4小时经尾静脉注射进行移植实验。实验分组(1):新鲜脐血移植组(阳性对照组)每只N0D/SCID小鼠经尾静脉输注新鲜脐血200ul含MNCs5Xl(f个。(2):扩增脐血移植组(实验组)每只NOD/SCID小鼠经尾静脉输注与新鲜脐血组相同细胞数的经人骨髓基质细胞联合SCF+FL+TPO三因子组合悬浮培养扩增6天的脐血5X106个，200ul。(3):生理盐水移植组(阴性对照组)每只NOD/SCID小鼠输注200ul生理盐水。每组5只，重复4次。移植后观察小鼠存活情况，6周后处死存活小鼠，收集骨髓细胞用于人CD34+，CD45+细胞的检测及抽提基因组DNA检测人特异的ALU序列和Cart-1基因。PCR法检测人特异的ALU序列和Cart-1基因以新鲜脐血基因组DNA为阳性对照，正常NOD/SCID小鼠骨髓基因组DNA为阴性对照，e-actin作为内参照.酚/氯仿法抽提移植NOD/SCID小鼠骨骨髓细胞基因组DNAPCR引物由上海博亚生物技术有限公司合成，{3-actin由英俊生物技术有限公司合成，Alu序列引物正义链5'-CTGGGCGACAGAACGAGATTCTAT-3'，反义链5'-CTCACTACTTGGTGACAGGTTCA-3',扩增片段为224bp，为位于人x染色体重复序列。Cart-1基因引物正义链5'-AAGGATACCACAATAAGCTGC-3'，反义链5'-GGTTTGTGGAGACTGGCAC-3'，扩增片段为156bp,仅位于Cart-1基因3，-端翻译序列，二者皆与鼠无同源性。0-actin内参照正义链5'-AAGGCCAACCGCGAGAAGAT-3'，反义链5'-TCGGTGAGGATCTTCATGAG-3'，扩增片段为249bp，扩增Alu，Cart-1和P-actin的反应体系和条件相同。反应体系(25u1):IOX缓冲液2.5pl，TaqDNA聚合酶1.25U，dNTPO.2mol/L，引物各0.25umol/L,DNA3ul,反应参数95"C预变性5min，95。C变性30s，54。C退火45s，72°C延伸45s,循环30次，72"C补齐延伸5min,扩增产物以20g/L琼脂糖凝胶电泳分析结果。空白对照组小鼠存活率为0，均在1周内死亡，新鲜脐血组20只小鼠中存活7只，存活率35%，扩增组20只小鼠存活IO只，存活率50%，其余均在移植后23周内死亡，扩增组6周存活率较新鲜组小鼠的要好(P<0.05)。NOD/SCID小鼠中人的造血细胞植入证据，在移植后存活6周的NOD/SCID小鼠骨髓细胞中我们检出人CD45+细胞含量范围为1.52%—5.2%，说明存活的小鼠均获得脐血造血细胞的植入。移植后存活6周的小鼠外周血细胞与阳性对照相同，扩增出224bp和156bp的特异性条带，表明存在人的造血细胞。存活的NOD/SCID小鼠均能检测到人的Alu基因、Cart-I基因。阴性对照组小鼠未检测到任何特异性条带。以上数据表明，采用本发明的方法，可以达到提高脐血造血干/祖细胞体外扩增效率及增强或维持其植入NOD/SCID小鼠能力的目的，证明本采用本发明的方法进行的脐血单个核细胞的体外扩增，能够大大提高扩增效率，并且使扩增的细胞保持较好造血细胞植入能力。权利要求1、脐血单个核细胞体外扩增并保持造血细胞植入能力的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)取骨髓液，分离出单个核细胞，用培养液培养出骨髓基质细胞；(2)步骤(1)培养的基质细胞层融合后，经15Gy^Co照射，洗涤；(3)将经歩骤(2)后基质细胞加入无血清培养液中；(4)往步骤(3)的培养液中加入外源性细胞因子，建立造血细胞培养体系；(5)从脐血中分离出单个核细胞，种植到步骤(4)建立的造血细胞培养体系中进行培养扩增。2、根据权利要求1所述的脐血单个核细胞体外扩增并保持造血细胞植入能力的方法，其特征在于，歩骤(3)所述的骨髓基质细胞为人骨髓基质细胞。3、根据权利要求1所述的脐血单个核细胞体外扩增并保持造血细胞植入能力的方法，其特征在于，步骤(3)所述的无血清培养液为StemspanTm无血清培养液。4、根据权利要求1所述的脐血单个核细胞体外扩增并保持造血细胞植入能力的方法，其特征在于，步骤(4)所述的外源性细胞因子包含SCF、FL和TPO。5、根据权利要求2所述的脐血单个核细胞体外扩增并保持造血细胞植入能力的方法，其特征在于，所述的外源性细胞因子SCF、FL和TPO的浓度均为40ng/ml。6、根据权利要求1所述的脐血单个核细胞体外扩增并保持造血细胞植入能力的方法，其特征在于，步骤(1)中培养人骨髓基质细胞的培养液为IMDM。7、根据权利要求1所述的脐血单个核细胞体外扩增并保持造血细胞植入能力的方法，其特征在于，步骤(5)所述的培养扩增的条件为37°C，体积分数为5%的0)2全湿培养箱中培养。全文摘要本发明提供了一种脐血单个核细胞体外扩增并保持造血细胞植入能力的方法，其是从人骨髓中培养出骨髓基质细胞，并作为培养体系中的支持细胞，在结合外源性生长因子的无血清培养体系中体外扩增脐血单个核细胞。采用本发明的方法进行的脐血单个核细胞的体外扩增，能够大大提高扩增效率，并且能使扩增的细胞保持较好造血细胞植入能力。文档编号C12N13/00GK101121927SQ20071002907公开日2008年2月13日申请日期2007年7月9日优先权日2007年7月9日发明者逸应,张玉平,彭盘俐,杜庆华,林秀梅,平毛,王彩霞,王汉平,莫文健,力许,许艳丽申请人:广州市第一人民医院