一种化学诱导玉米孤雌生殖的操作方法
【专利摘要】本发明提供一种化学诱导玉米孤雌生殖的操作方法，其特征在于吐丝前对雌穗严格套袋，当雌穗花丝吐出4天~5天时，摘下纸袋，用改进的尖咀钳隔着苞叶掐花丝，之后用手拔出花丝，花丝拔出后留下一孔洞；用注射器向孔洞内注入诱导剂，以2~5ml为宜。最后将纸袋套回完成处理过程。本发明.解决了剧毒试剂的安全使用问题和.彻底解决了以往花粉污染问题，操作过程在完全开放条件下进行。施药效果好，全天候作业，操作简单、处理速度、适合规模化应用。
【专利说明】
一种化学诱导玉米孤雌生殖的操作方法
技术领域
[0001]本发明属于玉米育种技术领域，特别是一种化学诱导玉米孤雌生殖的操作方法。
【背景技术】
[0002]选育玉米自交系的常规方法，育成一个自交系至少需要经过7代以上的连续自交，对于遗传背景复杂的材料甚至要10代以上。为了加快玉米自交系的选育速度，缩短育种周期，提高自交系纯度，国内外通常采用化学诱导法和遗传诱导方法:
1.秋水仙素诱导法
利用秋水仙素能阻止细胞分裂而导致染色体加倍的原理，用秋水仙素诱导剂诱导玉米孤雌生殖。其主要做法是，在玉米吐丝期，用一定浓度的秋水仙素涂抹花丝，使其不经过双受精而通过孤雌生殖直接产生纯合的二倍体种子。
[0003]秋水仙素是常用的染色体加倍处理剂，其突出优点是诱导率高，因此在教学和科研中被长期使用。但是，尽管秋水仙素诱导玉米孤雌生殖已是一种成熟的快速选育玉米自交系技术，但是由于其剧毒、致癌、成本高以及处理方法上的缺陷而未能在规模化育种中应用。
[0004]除草剂诱导法
为了避免剧毒的秋水仙素导致人身安全隐患，后来有以除草剂替代秋水仙素来诱导玉米孤雌生殖，取得了良好效果。除草剂是一种低毒农药，其中某些除草剂如氟乐灵、炔苯酰草胺等与秋水仙素一样具有诱导染色体加倍的功能。与秋水仙素相比，除草剂具有对人畜安全、方法简单、操作容易、成本低、效率高等优点。但现有操作方法在防止花粉污染、处理效率等方面仍具局限性。
[0005]归纳上述方法存在的问题，主要有:
1.安全问题。秋水仙素属于剧毒试剂，致癌性强。为了尽量避免与人体接触，现有技术均采取向花丝涂抹或向吐出的花丝注射诱导剂的方式，但极易造成刮碰和药液滴落，对人体健康造成威胁。
[0006]2.花粉污染问题。向花丝涂抹诱导剂，需要在严格的套袋情况下，或在遮挡，或避开散粉时间情况下进行，但花粉污染问题仍很严重，产生大量假种子，特别是在海南气候条件下全天都存在污染机会。
[0007]3.由于花丝亲水性差，花丝间空隙很小，向吐出的花丝涂抹和注射只能使一部分花丝接触到药液，难以达到理想的施药效果。因此，为了保证安全和较好处理效果，操作时十分谨慎，速度缓慢、效率很低。
[0008]遗传诱导法
用Stock 6等遗传诱导系给被诱导的试材授粉，诱导产生单倍体种子。之后再用秋水仙素等染色体加倍处理剂将种子或幼苗加倍成二倍体植株。此方法被认为是目前世界上最先进的方法。然而，仍存在以下问题:
(I)诱导产生的单倍体种子，需根据标记性状从大量的玉米粒中挑出。因此，工作量大、效率低、枯燥乏味，且难以实现机械化；
(2)由于遗传背景、成熟度、籽粒形状、果皮厚度、籽粒着生位置等原因，还存在显色效果不佳甚至不显色的问题，因此难以辨认；
(3)诱导产生的单倍体种子须再经过染色体加倍才能成为正常的二倍体植株，而加倍过程繁琐、且加倍率低;在利用秋水仙素进行染色体加倍时，处理后的废液属于剧毒、致癌物质，需要严格的无害化处理；
(4)无论是采用药剂加倍还是依靠自然加倍，诱导后的第一代植株绝大多数在染色体倍性上属于嵌合体，只有极少量的花药有育性。因此，授粉十分困难。
【发明内容】
[0009]本发明要解决的技术问题是:(I)解决化学诱导处理剂的安全使用问题，无论是使用剧毒试剂秋水仙素还是使用除草剂诱导，都可实现安全操作；(2)简化处理方法、减化选育程序、提高处理效率;(3)彻底解决花粉污染问题;(4)实现规模化应用。
[0010]本发明采用的技术方案如下:
1.诱导剂
配制常规的秋水仙素(COL)诱导剂，或以秋水仙素与二甲基亚砜(DMS0)、青鲜素(MH)混合成复配剂;氟乐灵、炔苯酰草胺等除草剂类诱导剂。
[0011]雌穗套袋和处理时期
在吐丝前对玉米雌穗严格套袋，吐丝后4?5天进行诱导处理，一般品种此时处于散粉结束期。
[0012]工具
(I)改进的尖嘴钳:选用6〃?7〃左右规格的尖嘴钳。用砂轮打磨尖嘴钳无刃口的一侧，使钳口的刃口部分延长，制成具有单面掐切功能的钳口。同时，将钳口一侧的刃口部位稍稍磨平，使钳口闭合时形成Imm?2mm缝隙，并使韧口变钝，用于掐切玉米花丝。
[0013](2)注射器:规格为20ml左右，使用方便。
[0014](3)矿泉水瓶。用于盛装处理液，选用规格为250ml左右的矿泉水瓶以便于放入大褂下兜内。
[0015]诱导处理
诱导处理前先将盛有处理液的药瓶放在大褂下兜，将注射器插入瓶口，注射器的手柄刚好卡在瓶口上使注射器盖在药瓶上方，方便取放。
[0016]处理时先摘掉雌穗纸袋，左手抓起花丝，右手拿尖咀钳掐花丝。掐的位置以花苞顶端向下接近雌穗幼穗顶端的位置为佳，一般从顶端向下3?6cm左右。掐花丝时隔着苞叶进行，以适当的速度逐渐增加压力，隔着苞叶将花丝挤断而苞叶不致破损。掐时明显感觉到花丝被掐断时即可。
[0017]花丝掐断后，用左手将掐断的花丝慢慢拔出，花丝拔出后则留下一空洞。之后用注射器向孔洞内注入诱导剂，诱导剂不必装满，其用量依果穗粗细及孔洞的深浅而定，以2?5ml为宜。注入药剂后将纸袋套回，完成处理过程。
[0018]对于幼穗上部苞叶过长或苞叶包裹过紧的花苞，可将顶部一小段苞叶扒开，使花丝容易地拔出。注意不要掐破苞叶，以免漏药。
[0019]收获与繁殖
种子成熟时收获，得到基因型纯合的二倍体种子。下一季播种鉴定，便获得自交系。此后按常规育种方法进行。
[0020]本发明的积极效果如下:
1.解决了剧毒试剂的安全使用问题
该方法采用孔洞施药和注射器注入，避免了以往涂抹方法的药液流淌、滴落和刮碰，即使采用秋水仙素作为处理液，也不会对人体健康造成威胁。
[0021 ]彻底解决了现有技术的花粉污染问题
整个操作过程在完全开放条件下进行。由于孔洞很小，花粉落入几率很低，即使有花粉落入也会由于花粉遇到处理液后会因吸水膨胀而破裂死亡，彻底解决了花粉污染问题。
[0022]施药效果好
孔洞深、孔洞周围包裹严、药液容纳量大，使所有花丝都能接触药液，且药液存留时间长。
[0023]全天候作业
不受时间、温度、湿度、光照、阴雨影响，可全天候作业。
[0024]操作简单、处理速度、适合规模化应用
程序简单、方法简便、使用安全、处理速度远远快于现有其他方法，一般每分钟可处理5穗以上。可大规模应用。
【附图说明】
[0025]图1是具有单面掐切功能的掐切工具。
【具体实施方式】
[0026]以下各实施例中涉及的玉米品种均为市场公开销售的品种。
[0027]实施例1诱导玉米孤雌生殖的操作方法 (I)配制诱导剂
将秋水仙素(C0L)用水稀释成0.15%浓度的诱导剂。
[0028](2)处理试材
处理对象为玉米杂交种‘先玉335，。
[0029](3)果穗处理
工具为改进的尖嘴钳(见图1):选用6〃?7〃左右规格的尖嘴钳。用砂轮打磨尖嘴钳无刃口的一侧，使钳口的刃口部分B延长，制成具有单面掐切功能的钳口。同时，将钳口一侧的刃口部位稍稍磨平，使钳口闭合时形成Imm?2mm缝隙A，并使韧口变钝，用于掐切玉米花丝。
[0030]吐丝前对雌穗进行严格套袋。花丝吐出后第4天，摘下纸袋，左手抓起花丝，右手持改进的尖嘴钳，在雌穗花苞顶部向下4cm左右接近雌穗幼穗处，用尖嘴钳掐雌穗花苞，当感觉到苞叶内的花丝已经被掐断时说明已完成掐花丝过程。之后用手慢慢拔出花丝，对于苞叶过长的果穗可先扒开顶部一小段苞叶使花丝容易拔出，花丝拔出后留下一孔洞。
[0031](4)注入诱导剂
用注射器向孔洞注入诱导剂，注入量约3ml左右，最后套回纸袋。
[0032](5)收获
成熟时收获果穗，获得基因型纯合的二倍体种子。经过下一代鉴定得到纯系。此后按常规方法进行测配和繁殖。
[0033]实施例2诱导糯玉米孤雌生殖的操作方法 (I)配制诱导剂
选用市场上销售的秋水仙素和二甲基亚砜(DMSO)，用水稀释复配成0.2%秋水仙素+2%二甲基亚砜的诱导剂。
[0034](2)处理试材
处理对象为糯玉米杂交种‘沈糯3号’。
[0035](3)果穗处理
吐丝前对雌穗进行严格套袋。当花丝吐出后4天，摘下纸袋，左手抓起花丝，右手持改进的尖嘴钳，在雌穗花苞顶部向下接近雌穗幼穗处，用尖嘴钳掐雌穗花苞，当感觉到苞叶内的花丝已经被掐断时即可。之后用手慢慢拔出花丝，留下一孔洞。
[0036](4)注入诱导剂
用注射器向孔洞注入3ml左右诱导剂，以不溢出为宜。最后套回纸袋。
[0037](5)收获
成熟时收获果穗，获得基因型纯合的二倍体种子。经过下一代鉴定得到纯系。此后按常规方法进行。
[0038]实施例3诱导甜玉米孤雌生殖的操作方法 (I)配制诱导剂
选用市场上销售的秋水仙素、二甲基亚砜和青鲜素(MH)，用水稀释复配成0.2%秋水仙素+2%二甲基亚砜+40mg.kg-1青鲜素的诱导剂。
[0039](2)处理试材
处理对象为甜玉米杂交种“沈甜6号”。
[0040](3)果穗处理
吐丝前对雌穗进行严格套袋。当花丝吐出后4天?5天，摘下纸袋，左手抓起花丝，右手手持改进的尖嘴钳，在雌穗花苞顶部向下4cm左右接近雌穗幼穗处，用尖嘴钳掐雌穗花苞，当感觉到苞叶内的花丝已经被掐断时即可。之后用慢慢手拔出花丝，形成一孔洞。
[0041](4)注入诱导剂
用注射器向孔洞注入3ml?5ml左右诱导剂，最后套回纸袋。
[0042](5)收获
成熟时收获果穗，获得基因型纯合的二倍体种子。经过下一代鉴定得到纯系。此后按常规方法进行测配和繁殖。
[0043]实施例4诱导爆裂玉米孤雌生殖的操作方法
(I)配制诱导剂
选用市场上销售的氟乐灵除草剂，用水稀释成SOppm的诱导剂。
[0044](2)处理试材
处理对象为爆裂玉米杂交种“沈爆3号”。
[0045](3)果穗处理吐丝前对雌穗进行严格套袋。当花丝吐出后4天，摘下纸袋，左手抓起花丝，右手持改进的尖嘴钳，在雌穗花苞顶部向下接近雌穗幼穗处，以适当速度和力度用尖嘴钳掐雌穗花苞，当感觉到苞叶内的花丝已经被挤断时即可。之后用手慢慢拔出花丝，留下一孔洞。
[0046](4)注入诱导剂
用注射器向孔洞注入3?4ml左右诱导剂，以不溢出为宜。最后套回纸袋。
[0047](5)收获
成熟时收获果穗，获得基因型纯合的二倍体种子。经过下一代鉴定得到纯系。此后按常规方法进行测配和繁殖。
【主权项】
1.一种化学诱导玉米孤雌生殖的操作方法，其特征在于:事先按常规方法在吐丝前对雌穗严格套袋，当花丝吐出4天?5天时，摘下纸袋，左手抓起花丝，右手拿改进的尖咀钳掐花丝，掐的位置以从花苞顶端向下接近雌穗幼穗顶端的位置为佳，掐花丝时隔着苞叶进行，以适当的速度逐渐增加压力，隔着苞叶将花丝挤断而不致苞叶破损，掐时明显感觉到花丝被掐断时即可，之后用手慢慢将花丝拔出；对于苞叶过长或苞叶包裹过紧的，可扒开顶端一小段苞叶使花丝更容易拔出，花丝拔出后留下一孔洞； 花丝拔出后留下一孔洞，用注射器向孔洞内注入诱导剂，其用量依孔洞粗细及深浅而定，以2?5ml为宜;最后将纸袋套回，完成处理过程。2.根据权利要求1所述的一种化学诱导玉米孤雌生殖的操作方法，其特征在于:整个操作过程在不需要任何防止花粉污染措施的完全开放条件下，及不受时间、温度、湿度、光照和阴雨影响的全天候进行。
【文档编号】A01H1/08GK105941140SQ201610337745
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月22日
【发明人】史振声, 李凤海, 钟雪梅, 朱敏, 王志斌, 张喜华
【申请人】沈阳农业大学, 沈阳特亦佳玉米科技有限公司