Dna甲基化抑制剂在提高玉米父本单倍体诱导系诱导效率中的应用的制作方法
【专利摘要】DNA甲基化抑制剂在提高玉米父本单倍体诱导系诱导效率中的应用，涉及玉米育种领域，解决了在现有方法中通过单倍体诱导系之间杂交或者诱导系与普通系杂交，后在杂交后代中选育优良诱导系、提高单倍体诱导效率时存在的操作复杂、耗费时间长、见效慢的问题。该应用为采用DNA甲基化抑制剂处理玉米父本单倍体诱导系。本发明利用DNA甲基化抑制剂处理玉米诱导系，经过处理后玉米诱导系的单倍体诱导效率显著提高；只需要一步药剂处理工作就能提高玉米诱导系的单倍体诱导效率，不需要复杂的筛选和纯化过程，操作简便，具有短时高效的明显优势。
【专利说明】DNA甲基化抑制剂在提高玉米父本单倍体诱导系诱导效率中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及玉米育种【技术领域】，具体涉及一种DNA甲基化抑制剂在提高玉米父本单倍体诱导系诱导效率中的应用。
【背景技术】
[0002]玉米育种过程的核心是优良自交系的选育。传统的方法是利用多代自交选育自交系，利用该方法获得相对纯合的自交系至少需要6至8代，所需时间较长。
[0003]当某些遗传材料通过有性杂交能诱导对方产生较高频率的单倍体时，将该遗传材料称之为单倍体诱导系。玉米父本单倍体诱导系(简称诱导系)是一种特殊的玉米材料，利用其做父本对其他品系杂交授粉时可以产生一定比例的单倍体，后经过染色体加倍即可以获得纯系。
[0004]基于诱导系的单倍体诱导技术可以在两个世代内得到一个纯合的自交系，能够大大提高玉米育种的效率，是加速良种繁育的有效途径。为了对诱导系进一步优化，国内外研究人员开展了大量相关研究:“Stock6”是在玉米中发现的第一个诱导系；1978年，Aman等发现可以通过选择大幅度提高Stock6诱导单倍体的频率(Aman MA, Sarkar KR.Selectionfor haploidy inducing potential in maize.1ndian J Genet, 1978, 38:452-457.);宋同明等用高油玉米改良群 体BHO和Stock6杂交，经多代自交和测交选育出“农大高诱I号”诱导系(刘志增，宋同明，腾文涛，薛国宾，刘丽娟.玉米孤雌生殖诱导系的选育方法研究.中国农业大学学报，2000，5:56-57.) ;Chalyk等用KMS和ZMS杂交作为基础材料，后自交选育出诱导率达6.5%、籽粒标记明显的诱导系MHI (KMS和ZMS都是Stock6的衍生系)(Chalyk ST.Creating new hap1id-1nducing lines of maize.Maize Genet CoopNewslett.1999，73:53-54.);德国育种家利用俄罗斯的诱导综合种KEMS与法国的WS14杂交，育成了诱导系 RWS (Rober FK, Gordillo GA, Geiger HH.1n vivo haploid inductionin maize-performance ofnew inducers and significance of doubled haploid linesin hybrid breeding.Maydica.2005, 50:275-283.);陈绍江等在“农大高诱 I 号”的基础上选育出二代诱导系(陈绍江，黎亮，李浩川，玉米单倍体育种技术.北京:中国农业大学出版社，2009.);才卓等用田间可自发产生单倍体植株、籽粒带有紫斑的M278与Stock6杂交选育的“吉高诱系3号”(才卓，徐国良，刘向辉，董亚琳，代玉仙，李淑华.玉米高频率单倍体生殖诱导系吉高诱系3号的选育.玉米科学，2007，15:1-4.)。
[0005]基于诱导系的单倍体诱导技术在美国先锋公司、孟山都公司、法国利马格兰公司、瑞士先正达公司和德国KWS公司等都已大规模应用，单倍体诱导选系正逐步替代传统选系方法。据不完全统计，2010年美国先锋公司通过单倍体诱导技术培育的玉米核心自交系是过去80年的总和，德国KWS公司每年利用单倍体诱导技系可产生1500~2000个纯系，目前国外大约60%的马齿型自交系和30%的硬粒型自交系均由单倍体诱导技术而选育。基于玉米诱导系的单倍体诱导技术的一个难点为单倍体诱导效率低，而单倍体诱导效率又直接影响了育种的进程和成本。因此，如何提高单倍体诱导效率是利用单倍体诱导技术研究的首要问题。
[0006]目前，提高诱导系单倍体诱导效率的方法是通过单倍体诱导系之间杂交或者诱导系与普通系杂交后从杂交后代中选育优良诱导系，该方法虽然在一定程度上提高了单倍体诱导效率，但是利用上述方法选育诱导系操作复杂，耗费时间长，且见效慢。
【发明内容】
[0007]为了解决现有通过单倍体诱导系之间杂交或者诱导系与普通系杂交后从杂交后代中选育优良诱导系提高单倍体诱导效率的方法存在的操作复杂、耗费时间长、见效慢的问题，本发明提供一种DNA甲基化抑制剂在提高玉米父本单倍体诱导系诱导效率中的应用及方法。
[0008]本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下:
[0009]DNA甲基化抑制剂在提高玉米父本单倍体诱导系诱导效率中的应用，采用DNA甲基化抑制剂处理玉米父本单倍体诱导系。
[0010]所述DNA甲基化抑制剂为5-氮杂胞嘧啶核苷或5-氮杂_2，-脱氧胞嘧啶核苷。
[0011]当所述DNA甲基化抑制剂为5-氮杂胞嘧啶核苷时，其使用浓度为10~500 μ Μ。
[0012]本发明还提供一种提高玉米父本单倍体诱导系诱导效率的方法，该方法包括采用DNA甲基化抑制剂处理玉米父本单倍体诱导系的雄穗以提高玉米父本单倍体诱导系诱导效率的步骤。
[0013]所述DNA甲基化抑制剂为5-氮杂胞嘧啶核苷或5-氮杂_2’ -脱氧胞嘧啶核苷。
[0014]当所述DNA甲基化抑制剂为5-氮杂胞嘧啶核苷时，其使用浓度为10~500 μ Μ。
[0015]当采用DNA甲基化抑制剂处理玉米父本单倍体诱导系的雄穗时，需要连续处理5~10天。
[0016]当采用DNA甲基化抑制剂处理玉米父本单倍体诱导系的雄穗时，需要连续处理7天。
[0017]处理的时期为玉米父本单倍体诱导系的雄穗分化期，采用DNA甲基化抑制剂处理没有散粉的雄穗。
[0018]发明原理:甲基化是指向底物引入甲基的过程，一般是以甲基取代氢原子。生物系统中的甲基化是表观遗传学的修饰形式，包括DNA甲基化和蛋白质甲基化。DNA甲基化是指在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶，蛋白质甲基化一般是指精氨酸或赖氨酸在蛋白质序列中的甲基化。
[0019]DNA甲基化抑制剂是指一类能使基因组甲基化水平降低的碱类化合物，包括5-氮杂胞嘧啶核苷和5-氮杂-2’ -脱氧胞嘧啶核苷等，利用DNA甲基化抑制剂处理植株，可以使植株整体甲基化水平降低，出现一些新表型，如亚麻的矮化和早熟，水稻白叶枯抗性，菊花早开花等，深入研究发现这些植物性状的改变可能与DNA甲基化抑制剂处理后导致的染色体结构改变、基因表达及形态变化和细胞程序性死亡有关。
[0020]本发明的有益效果是:
[0021]1、本发明利用DNA甲基化抑制剂处理玉米诱导系，对原有诱导系材料进行了改良，通过实验证明，经过处理后玉米诱导系的单倍体诱导效率显著提高。[0022]2、本发明的方法只需要一步药剂处理工作就能提高玉米诱导系的单倍体诱导效率，不需要复杂的筛选和纯化过程，操作十分简便。
[0023]3、本发明的方法具有短时高效的明显优势，主要应用于玉米育种过程中。
[0024]4、本发明中，经过植物DNA甲基化抑制剂处理后的植株在单倍体诱导效率这一性状上具有一定的遗传性。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1为实施例1中以“先玉335”作母本检测50 μ M的5_氮杂胞嘧啶核苷对诱导系“单绿”单倍体诱导效率的影响结果图；
[0026]图中:a、b的柱高表示在P=0.05水平上差异显著。
[0027]图2为实施例2中以“郑单958”作母本检测500 μ M的5-氮杂胞嘧啶核苷对诱导系“单绿”单倍体诱导效率的影响结果图； [0028]图中:a、b的柱高表示在P=0.05水平上差异显著。
[0029]图3为实施例3中以“先玉335”作母本检测10 μ M的5_氮杂胞嘧啶核苷对诱导系“单紫”单倍体诱导效率的影响结果图；
[0030]图中:a、b的柱高表示在P=0.05水平上差异显著。
[0031]图4为实施例4中以“先玉335”作母本检测100 μ M的5-氮杂胞嘧啶核苷对诱导系“单紫”单倍体诱导效率的影响结果图；
[0032]图中:a、b的柱高表示在P=0.05水平上差异显著。
【具体实施方式】
[0033]以下结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
[0034]实验材料:
[0035]父本材料即诱导系采用由中国科学院东北地理与农业生态研究所玉米遗传与分子育种学科组引进国外基础材料“st0Ck6”经杂交改良选育而成的“单绿”和“单紫”，该材料具有散粉量大、结实性较好等优良性状，并且含有紫色籽粒标记。
[0036]母本材料采用现有玉米品种中的一种，具体可以选择“郑单958”或“先玉335”。
[0037]5-氮杂胞嘧唳核苷购自于Sigma-Aldrich。
[0038]实施例1
[0039]步骤一、播种
[0040]父本材料选择由中国科学院东北地理与农业生态研究所玉米遗传与分子育种学科组引进国外基础材料“stock6”经杂交改良选育而成的“单绿”，母本材料选择“先玉335”。
[0041]春季播种，采用常规大田种植，为了使父母本材料的花期相遇，父本材料和母本材料分别分成两期播种，即各自种植两期。
[0042]步骤二、药物处理
[0043]选取雄穗处于小穗分化期的诱导系“单绿”，将其随机分成三组:第一组采用浓度为50 μ M的5-氮杂胞嘧啶核苷水溶液，利用棉浸法处理未散粉的雄穗，连续处理7天，即为药物处理组；第二组采用纯水，利用棉浸法处理未散粉的雄穗，连续处理7天，即为水处理对照组；第三组不做处理，自然生长至散粉，即为自然生长对照组。
[0044]在使用DNA甲基化抑制剂处理玉米诱导系时药物浓度和处理时间也特别重要，如果浓度过低可能起不到较好的效果，浓度过高又会影响植株的正常生长发育，处理时间过长或过短也会带来相应的影响。
[0045]处理后观察发现:药物处理组、水处理对照组及自然生长对照组均能散粉，并且在植株形态上没有显著差别。
[0046]步骤三、花粉活力的检测
[0047]待玉米诱导系雄穗散粉后，采用氯化三苯基四氮唑法(TTC法)对玉米诱导系的花粉活力进行检测，结果见表一。
[0048]表一:50 μ M的5-氮杂胞嘧啶核苷处理对“单绿”花粉活力的影响
[0049]
【权利要求】
1.DNA甲基化抑制剂在提高玉米父本单倍体诱导系诱导效率中的应用，其特征在于，采用DNA甲基化抑制剂处理玉米父本单倍体诱导系。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述DNA甲基化抑制剂为5-氮杂胞嘧啶核苷或5-氮杂-2’ -脱氧胞嘧啶核苷。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，当所述DNA甲基化抑制剂为5-氮杂胞嘧啶核苷时，其使用浓度为10~500 μ M。
4.一种提高玉米父本单倍体诱导系诱导效率的方法，其特征在于，该方法包括采用DNA甲基化抑制剂处理玉米父本单倍体诱导系的雄穗以提高玉米父本单倍体诱导系诱导效率的步骤。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述DNA甲基化抑制剂为5-氮杂胞嘧啶核苷或5-氮杂-2’ -脱氧胞嘧啶核苷。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，当所述DNA甲基化抑制剂为5-氮杂胞嘧啶核苷时，其使用浓度为10~500 μ Μ。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，当采用DNA甲基化抑制剂处理玉米父本单倍体诱导系的雄穗时，需要连续处理5~10天。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，当采用DNA甲基化抑制剂处理玉米父本单倍体诱导系的雄穗时，需要 连续处理7天。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，处理的时期为玉米父本单倍体诱导系的雄穗分化期，采用DNA甲基化抑制剂处理没有散粉的雄穗。
【文档编号】A01H1/02GK103733979SQ201310717277
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年12月23日 优先权日:2013年12月23日
【发明者】敖曼, 关义新, 关海英, 刘洪禹, 谢琦 申请人:中国科学院东北地理与农业生态研究所