专利名称：一种生产重组混合l-阿拉伯糖异构酶的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及构建微生物工程菌生产重组蛋白。具体是应用微生物工程菌生产重组混合L-阿拉伯糖异构酶。
背景技术：
L-阿拉伯糖异构酶(L-arabinose isomerase EC 5. 3. I. 4)是由微生物产生的、具有变构作用的酶。L-阿拉伯糖异构酶能催化L-阿拉伯糖为L-核酮糖；由于L-阿拉伯糖和D-半乳糖结构的相似性，故L-阿拉伯糖异构酶也能催化D-半乳糖异构为D-塔格糖。D-塔格糖是甜味剂，具有低能量，降低血糖和抗龋齿等功能。虽然多种微生物具有产生L-阿拉伯糖异构酶的功能，但是，当前的塔格糖产品仍然是主要来源于化学合成。化学合成D-塔格糖的工序复杂，生产价格高，并且产生大量中间产品污染环境。应用L-阿拉伯糖异构酶将廉价的D-半乳糖异构为D-塔格糖，操作简单，如果有合适的L-阿拉伯糖异构酶那么这一生产方式获得的D-塔格糖将是价格便宜。异构D-半乳糖异构为D-塔格糖的理想反应条件是pH5. 0-6. 0，> 60°C，并且，反应温度越高，反应速度就越快。前者有利于减少中间副产品的生成，后者有利于D-半乳糖异构为D-塔格糖。虽然多种微生物具有产生L-阿拉伯糖异构酶的功能，但是，至今目前尚未发现符合最适PH5. 0-6. O并且最适温度> 60°C的L-阿拉伯糖异构酶，从而影响了用L-阿拉伯糖异构酶生产D-塔格糖产业的发展。毕赤酵母(P.pastoris,)是最近迅速发展的一种真核表达宿主,营养要求不高，适合于大规模生产方式，由于毕赤酵母分泌自身的蛋白很少，有利于表达产物的纯化。
发明内容
虽然来源于新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)的L-阿拉伯糖异构酶最适pH 7,最适合温度80°C,但是在80°C和pH6的条件下其L-阿拉伯糖异构酶仍然具有89%的它在最适温度和最适pH条件的酶活性；虽然来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)的L-阿拉伯糖异构酶最适pH 7. 5,最适温度80°C,但是,在80°C和PH6的条件下其L-阿拉伯糖异构酶仍然具有63%的它在最适温度和最适pH条件的酶活性；虽然来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的L-阿拉伯糖异构酶最适pH 5. 8,最适合温度55°C，但是在80°C和pH6的条件下其L-阿拉伯糖异构酶仍然具有32%的它在最适温度和最适PH条件下的酶活性。从上述可见，在符合工业用途的80°C和pH6的条件下，这三种不同来源的L-阿拉伯糖异构酶都是具有酶活性的，只是酶活性低于最适的温度和最适PH条件的酶活性。但是，在80°C和pH6的条件下上述这三种酶的活力之和显著高于其中的任何单种酶在它的最适温度和最适PH条件下的酶活性。若能增加酶的产量将能弥补它由于偏离最适合反应条件所造成的酶活性的损耗。本发明的目的是为了解决含单种L-阿拉伯糖异构酶基因的菌株生产的L-阿拉伯糖异构酶不能满足当前用L-阿拉伯糖异构酶异构D-半乳糖生产D-塔格糖的需求的问题，构建含嗜热脂肪芽孢杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架、新阿波、罗栖热袍菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架和大肠杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌，生产重组混合嗜热脂肪芽孢杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因编码的L-阿拉伯糖异构酶、新阿波罗栖热袍菌的L-阿拉伯糖异构酶基因编码的L-阿拉伯糖异构酶和大肠杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因编码的L-阿拉伯糖异构酶，通过增加酶的产量来弥补它们由于偏离最适合反应条件所造成的酶活性的损耗。本发明所采用的技术方案是I.克隆酶基因应用PCR技术，从嗜热脂肪芽孢杆菌基因组中克隆L-阿拉伯糖异构酶基因，从新阿波罗栖热袍菌基因组中克隆L-阿拉伯糖异构酶基因，从大肠杆菌基因组中克隆L-阿拉伯糖异构酶基因。2.获得构建表达载体所需的启动子，重组序列，信号肽，转录终止子序列和抗性基因。 3.构建如附图的毕赤酵母表达载体。4.将以上构建的含新阿波罗栖热袍菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架、嗜热脂肪芽孢杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架和大肠杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体转化毕赤酵母。筛选高表达新阿波罗栖热袍菌的L-阿拉伯糖异构酶基因编码的L-阿拉伯糖异构酶、嗜热脂肪芽孢杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因编码的L-阿拉伯糖异构酶和大肠杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因编码的L-阿拉伯糖异构酶的重组子作为含新阿波罗栖热袍菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架、嗜热脂肪芽孢杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架和大肠杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌。5.发酵含新阿波罗栖热袍菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架、嗜热脂肪芽孢杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架和大肠杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌生产重组混合L-阿拉伯糖异构酶。本发明构建含新阿波罗栖热袍菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架、嗜热脂肪芽孢杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架和大肠杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌生产重组混合新阿波罗栖热袍菌的L-阿拉伯糖异构酶基因编码的L-阿拉伯糖异构酶、嗜热脂肪芽孢杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因编码的L-阿拉伯糖异构酶和大肠杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因编码的L-阿拉伯糖异构酶的优势在于I.含新阿波罗栖热袍菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架、嗜热脂肪芽孢杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架和大肠杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌表达的L-阿拉伯糖异构酶的产量明显高于用含单种以上所述的酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌表达的L-阿拉伯糖异构酶的产量。2.由于毕赤酵母工程菌表达的新阿波罗栖热袍菌的L-阿拉伯糖异构酶基因编码的L-阿拉伯糖异构酶、嗜热脂肪芽孢杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因编码的L-阿拉伯糖异构酶和大肠杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因编码的L-阿拉伯糖异构酶在pH6. 0和80°C (符合异构D-半乳糖为D-塔格糖的生产条件要求)都具有异构D-半乳糖为D-塔格糖的酶活性，这种混合L-阿拉伯糖异构酶能够混合应用于异构D-半乳糖为D-塔格糖。
附图.含新阿波罗栖热袍菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架、嗜热脂肪芽孢杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架和大肠杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体p.毕赤酵母三磷酸甘油醛脱氢酶启动子；S. α因子信号肽；Genel.新阿波罗栖热袍菌的L-阿拉伯糖异构酶基因；Gene 2.嗜热脂肪芽孢杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因；Gene3.大肠杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因；TT.转录终止子序列；G418.抗性基因(应用于筛选毕赤酵母重组子)；ColEl.大肠杆菌复制起点；AMP.氨苄青霉素抗性基因(应用于筛选大肠杆菌转化子)；p. pastoris rDNA.毕赤酵母的rDNA序列。
具体实施例方式下面用非限定性实施例对本发明作进一步说明。实施例I :I. I构建含新阿波罗栖热袍菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架、嗜热脂肪芽孢·杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架和大肠杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体I. I. I构建克隆载体由专业的DNA序列合成公司合成含氨苄青霉素(AMP)基因序列，多克隆接头和大肠杆菌复制起点的两条碱基互补的双链，并且在每条DNA链序列的两端形成粘性末端。通过DNA连接酶的作用使其环化，形成DNA克隆载体。将其克隆载体命名为pPL。1.1.2获取基因①PCR扩增新阿波罗栖热袍菌的L-阿拉伯糖异构酶基因引物I:5’ ccGAATTCatgatcgatctcaaacagtat3 [说明5’ 的 8 个喊基是酶切保护喊基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的6个碱基)]引物2:5，AAGCGGCCGCTTA ATGATGATGATGATGATG tctttttaaaagtccccagtagagttcgttcc3’提取新阿波罗栖热袍菌的基因组DNA，以新阿波罗栖热袍菌的基因组DNA为模板，应用引物I和引物2进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳证明PCR扩增出符合新阿波罗栖热袍菌的L-阿拉伯糖异构酶基因大小的扩增带。PCR产物经DNA序列测定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明其PCR扩增带是新阿波罗栖热袍菌的L-阿拉伯糖异构酶基因。②PCR扩增嗜热脂肪芽孢杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因。引物I :5’ gctacgtaatgctgtcattacgtccttatgaattttgg3> [说明5’ 的 8 个喊基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的6个碱基)]引物2:5，CAGCGGCCGCTTA ATGATGATGATGATGATG ccgcccccgccagaatacttcattccatc3，[说明5’的10个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(8个碱基)，方框中的18个碱基是编码6个组氨酸的DNA序列。]提取嗜热脂肪芽孢杆菌的基因组DNA，以嗜热脂肪芽孢杆菌的基因组DNA为模板，应用引物I和引物2进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳证明PCR扩增出符合嗜热脂肪芽孢杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因大小的扩增带。PCR产物经DNA序列测定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明其PCR扩增带是嗜热脂肪芽孢杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因。③PCR扩增大肠杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因序列。引物I :gcGAATTCatgacgatttttgataattatg3’ [说明5’ 的 8 个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的6个碱基)]引物2:5，CAGCGGCCGCCTA ,ATGATGATGATGATGATG gcgacgaaatccgtaatacacttcgtt3，[说 明5’的10个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的8个碱基)，方框中的18个碱基是编码6个组氨酸的DNA序列。]提取大肠杆菌基因组DNA，大肠杆菌基因组DNA为模板，应用引物I和引物2进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳证明PCR扩增出符合大肠杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因大小的扩增带。PCR产物经DNA序列测定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是大肠杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因序列。I. I. 3分别构建新阿波罗栖热袍菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架、嗜热脂肪芽孢杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架和大肠杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架(表达框架的DNA序列组成启动子-a因子信号肽-基因-转录终止子)。①用PCR扩增毕赤酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子序列。提取毕赤酵母的基因组DNA，应用以基因组DNA为模板，应用如下引物(5’CCTACGTAGGATCCTITITTGTAGAAATGTC3’，5’GGGCATGCTGTGTITTGATAGITGTTCAA 3’ ；)进行 PCR 扩增，PCR产物经序列测定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是其三磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子序列[如下序列的5’端和3’端的有下划线的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是三磷酸甘油醛脱氢酶启动子序列]:CCTACGTAGGATCCTTTTTTGTAGAAATGTCTTGGTGTCCTCGTCCAATCAGGTAGCCATCTCTGAAATATCTGGCTCCG TTGCAACTCCGAACGACCTGCTGGCAACGTAAAATTCTCCGGGGTAAAACTTAAATGTGGAGTAATGGAACCAGAAACGT CTCTTCCCTTCTCTCTCCTTCCACCGCCCGTTACCGTCCCTAGGAAATTTTACTCTGCTGAGAGCTTCTTCTACGGCCCC CTTGCAGCAATGCTCTTCCCAGCATTACGTTGCGGGTAAAACGGAGGTCGTGTACCCGACCTAGCAGCCCAGGGATGGAA AAGTCCCGGCCGTCGCTGGCAATAATAGCGGGCGGACGCATGTCATGAGATTATTGGAAACCACCAGAATCGAATATAAA AGGCGAACACCTTTCCCAATTTTGGTTTCTCCTGACCCAAAGACCTTAAATTTAATTTATTTGTCCCTATTTCAATCAAT TGAACAACTATCAAAACACAGCATGCCC[说明毕赤酵母基因组DNA提取方法将毕赤酵母细胞加于9mg/ml的蜗牛酶溶液(蜗牛酶用lmol/L山梨醇溶解)于30°C振摇30分钟，然后按照常规的细菌基因组DNA提取方法提取其基因组DNA。]②由专业的DNA序列合成公司合成a因子信号肽[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是a因子信号肽序列]:
CCGCATGCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACT ACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGC TGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAG AAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTACACTAGTCC③由专业的DNA序列合成公司合成转录终止子序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是转录终止子序列]:GGACTAGTCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGGTCTTGCTAGATTCTAATCAA GAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTTTTTATTTGTAACCTATATAGTATAG GATTTTTTTTGTCATTTTGTTTCTTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATCAGCCTATCTCGCAGCTGATGAATATCTTGTGG TAGGGGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTTCTTGGTATTTCCCACTCCTCTTCAGAGTACAGAAGATTAAGTG AGAAGTTCGTTTGTGCAAGCTTATCGATCC
④用套叠PCR法合成如下G418抗性基因序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是G418抗性基因序列]GGATCGATCCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATAC CATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTAT CGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAA ATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGC CATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACG CGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATT TTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCAT CAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTA ACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGT CGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCC TCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATGGTACCGG⑤从毕赤酵母基因组中PCR扩增rDNA序列PCR 引物引物I :5，CCGGTACCggcttccaggacgtatcgcggatcgctgcgttcttcatc3>引物2 :5，CCTTCGAAagccccgtggcacacgaccaatcttcccagccgaca 3，说明引物的5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位(有下划线的6个碱基)。提取毕赤酵母基因组DNA，以基因组DNA为模板，应用引物I和引物2进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是毕赤酵母基因组中的rDNA序列。⑥表达框架构建过程A.含新阿波罗栖热袍菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架的构建通过DNA限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用，将毕赤酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pPL载体的多克隆位点；将a因子信号肽DNA序列重组于pPL载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将新阿波罗栖热袍菌的L-阿拉伯糖异构酶基因序列重组于PPL载体的多克隆位点，并使其位于a因子信号肽DNA序列的下游；将转录终止子DNA序列重组于pPL载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含新阿波罗栖热袍菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架的载体称为pPLl。B.含嗜热脂肪芽孢杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架的构建通过DNA限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用，将毕赤酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pPL载体的多克隆位点；将a因子信号肽DNA序列重组于pPL载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将嗜热脂肪芽孢杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因序列重组于PPL载体的多克隆位点，并使其位于信号肽序列的下游；将转录终止子序列重组于PPL载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含嗜热脂肪芽孢杆菌的 L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架的载体称为pPL2。C.含大肠杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架的构建通过DNA限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用，将毕赤酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pPL载体的多克隆位点；将a因子信号肽DNA序列重组于pPL载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将大肠杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因序列重组于pPL载体的多克隆位点，并使其位于启动子的下游；将转录终止子序列重组于pPL载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含大肠杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架的载体称为PPL3。⑦完成表达载体的构建A.将三套表达框架组装于同一个克隆载体。通过DNA限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用，分别切取pPL2载体和pPL3载体表达框架，并将切下的这两套表达框架依次插入于pPLl的多克隆位点。此载体称为PPL123.B.通过DNA限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用依次将毕赤酵母的rDNA (DNA重组序列)和G418基因重组于pPL123载体的多克隆位点，构成含新阿波罗栖热袍菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架、嗜热脂肪芽孢杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架和大肠杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体(附图)。I. 2构建含新阿波罗栖热袍菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架、嗜热脂肪芽孢杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架和大肠杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌用电转化方法将含新阿波罗栖热袍菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架、嗜热脂肪芽孢杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架和大肠杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体转化毕赤酵母GS115，将经过电转化的GS115细胞涂布G418抗性平板。以重组子(在G418抗性平板上生长的克隆)基因组DNA为模板，分别用新阿波罗栖热袍菌的L-阿拉伯糖异构酶基因特异引物、嗜热脂肪芽孢杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因特异引物和大肠杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因特异引物进行PCR进行扩增，将扩增出符合目标分子量的PCR产物进行DNA序列测定而验证获得了正确的重组子。将含以上含三种L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母重组子接种于YPD[2%蛋白胨，1% yeastextract (酵母提取物)，2%葡萄糖]培养基中，30°C摇床培养两天，将发酵液离心，收获上清。应用发酵液进行SDS-PAGE (十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)，其结果表明出现新的符合这三个基因编码的酶蛋白分子量的蛋白条带。用His6融合蛋白纯化试剂盒纯化目标蛋白，用His标签单克隆抗体对纯化的两种目标蛋白进行蛋白印迹实验，结果表明这三种目标蛋白都能与His标签单克隆抗体结合，证明新阿波罗栖热袍菌的L-阿拉伯糖异构酶基因、嗜热脂肪芽孢杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因和大肠杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因都能在毕赤酵母中表达和分泌到胞外。筛选高表达以上所述的三种L-阿拉伯糖异构酶的重组子作为含新阿波罗栖热袍菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架、嗜热脂肪芽孢杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架和大肠杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌。I. 3生产重组混合新阿波罗栖热袍菌的L-阿拉伯糖异构酶基因编码的L-阿拉伯糖异构酶、嗜热脂肪芽孢杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因编码的L-阿拉伯糖异构酶和大肠杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因编码的L-阿拉伯糖异构酶
分别将含新阿波罗栖热袍菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架、嗜热脂肪芽孢杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架和大肠杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌，只含新阿波罗栖热袍菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌、只含嗜热脂肪芽孢杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌、只含大肠杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌和不含L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母分别接种于YPD培养基中，30°C摇床培养两天。分别收集其发酵液上清于PH6和80°C与D-半乳糖反应，然后测定D-塔格糖含量，根据D-塔格糖产量换算为L-阿拉伯糖异构酶活性并将结果记录于表I。表I结果表明含新阿波罗栖热袍菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架、嗜热脂肪芽孢杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架和大肠杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌的发酵液中的L-阿拉伯糖异构酶活性明显高于含新阿波罗栖热袍菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌发酵液中的L-阿拉伯糖异构酶活性，也高于含嗜热脂肪芽孢杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌的发酵液中的L-阿拉伯糖异构酶活性和含大肠杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌的发酵液中的L-阿拉伯糖异构酶活性，并且，前者的L-阿拉伯糖异构酶活性约是后三者的L-阿拉伯糖异构酶活性之和；表I结果还表明，在pH6和80°C条件下，混合L-阿拉伯糖异构酶活性明显高于其中任何一种L-阿拉伯糖异构酶在其最适的pH和温度下的酶活性。表I.发酵液的L-阿拉伯糖异构酶活性
权利要求
1.一种生产重组混合L-阿拉伯糖异构酶的方法。其特征在于应用分子生物学技术克隆新阿波罗栖热袍菌的L-阿拉伯糖异构酶基因、嗜热脂肪芽孢杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因和大肠杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因，构建含新阿波罗栖热袍菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架、嗜热脂肪芽孢杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架和大肠杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体；将上述构建的毕赤酵母表达载体转化毕赤酵母从而获得毕赤酵母重组子；筛选高表达重组混合新阿波罗栖热袍菌的L-阿拉伯糖异构酶基因编码的L-阿拉伯糖异构酶、嗜热脂肪芽孢杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因编码的L-阿拉伯糖异构酶和大肠杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因编码的L-阿拉伯糖异构酶的毕赤酵母重组子作为含新阿波罗栖热袍菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架、嗜热脂肪芽孢杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架和大肠杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌；用含新阿波罗栖热袍菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架、嗜热脂肪芽孢杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架和大肠杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌生产重组混合新阿波罗栖热袍菌的L-阿拉伯糖异构酶基因编码的L-阿拉伯糖异构酶、嗜热脂肪芽孢杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因编码的L-阿拉伯糖异构酶和大肠杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因编码的L-阿拉伯糖异构酶。
2.根据权利要求I所述一种生产重组混合L-阿拉伯糖异构酶的方法，其特征在于利用权利要求I所述的生产重组混合L-阿拉伯糖异构酶的方法制备重组混合L-阿拉伯糖异构酶产品。
3.根据权利要求I所述的一种生产重组混合L-阿拉伯糖异构酶的方法，其特征在于将按照权利要求I所述的生产重组混合L-阿拉伯糖异构酶的方法生产的重组混合L-阿拉伯糖异构酶，应用于制备D-塔格糖产品。
全文摘要
本发明公开了一种生产重组混合L-阿拉伯糖异构酶的方法。属生物技术领域。首先分别克隆嗜热脂肪芽孢杆菌、新阿波罗栖热袍菌和大肠杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因；构建含这三种L-阿拉伯糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体，并将其载体转化毕赤酵母获得工程菌；发酵毕赤酵母工程菌生产重组混合L-阿拉伯糖异构酶。这种重组混合酶不仅酶活性明显高于用毕赤酵母表达其中的单种酶，而且在pH6.0和80℃(符合异构D-半乳糖为D-塔格糖的生产条件要求)具有高的异构D-半乳糖为D-塔格糖的酶活性。本发明有利于解决因尚无符合最适pH5.0-6.0并且最适温度＞60℃的L-阿拉伯糖异构酶生产菌株而制约酶法生产D-塔格糖产业发展的问题，促进酶法生产D-塔格糖产业发展。
文档编号C12N15/61GK102719463SQ201210141968
公开日2012年10月10日 申请日期2012年5月2日 优先权日2012年5月2日
发明者尹慧祥, 崔艳艳, 张添元, 张爱联, 陈丽萍 申请人:中国热带农业科学院热带生物技术研究所