氨基转移酶和异构酶在催化形成L-allo-Ile中的应用
【技术领域】：
[0001] 本发明属于基因工程和生物催化技术领域，具体设及一类由憐酸化唉醒 (pyridoxalS，-phosphate,PLP)依赖的氨基转移酶（PLP-1inkedaminotransferase)和一 种新型异构酶（isomerase)组成的酶对，在共同协作催化形成心别异亮氨酸化-allo-Ile) 中的应用。
【背景技术】： W02] 异亮氨酸具有两个不对称中屯、，因此存在着4种立体异构体异亮氨 酸化-IIe)、D-异亮氨酸值-IIe)、k别异亮氨酸化-alIo-IIe)和D-别异亮氨酸 值-allo-Ile)，其对应关系如图1所示。除klle之外，D-Ile，kall〇-Ile和D-allo-Ile均 属于非蛋白质氨基酸，其在自然界中的存在已有相关报道。其中，L-allo-Ile由于其在自然 界中的广泛存在及重要科学意义，而引起了科学家们的特别关注。kallo-Ile于1985年首 次被报道发现，在随后的研究中，发现其除了存在于植物中，还可W作为结构单元存在于大 量的环肤抗生素，如来源于真菌的aureobasidinA，cordyheptapeptides和aspergillicin E，W及来源于放线菌的globomycin，巧pemycin，desotamides和marformycins(结构如图 2)。有趣的是，kallo-Ile还被发现存在于人体血浆中，在健康人群的血浆中，kallo-Ile 的浓度很低，处于几乎可W被检测的浓度水平；然而，在患有常染色体隐性遗传病一一枫糖 尿症（maplesyrupurinedisease)的病人血浆中，kall〇-Ile却因为病人的代谢缺陷而 得到累积，浓度达到5iiMW上，因此，kallo-Ile在血浆中的浓度水平已经作为诊断枫糖 尿症的重要手段之一。
[0003]kall〇-Ile与蛋白质氨基酸klle的结构非常相似，kall〇-Ile与klle的差别 在0位的碳原子上的甲基的构象不同。尽管kallo-Ile在结构上与L-Ile非常相似，W 及在自然界中广泛存在，但目前为止，生命体是如何生物合成kallo-Ile运种非蛋白质氨 基酸，W及在此过程当中设及的酶和酶促反应机制，还是一个未解之谜。
[0004]Desotamides和marformycins从分别从南海深海来源的链霉菌Streptomyces scopuliridisSCSIOZJ46 和Streptomyces化ozdowicziiSCSIO10141 分离纯化得到 的两类环肤类抗生素，研究表明，desotamides对革兰氏阳性细菌具有较好的抑制活性，而 marformycins对瘦疮丙酸杆菌（Propionibacteriumacnes)具有较好的抑制作用，是较好 的用于治疗瘦疮药物的先导化合物。更为重要的是，运两类环肤化合物结构中，均含有非 蛋白质氨基酸结构单元心日11〇-11日。目前，desotamides和margormycins的生物合成基 因簇己经被克隆，W上研究结果为我们在酶学水平上解释kallo-Ile的生物合成机制奠 定了重要的基础。kallo-Ile生物合成酶学机制的解释，将为利用绿色的酶学方法制备 L-allo-Ile，W及对枫糖尿症的诊断和治疗具有重要的实用意义。
【发明内容】
： 阳0化]本发明的目的是提供氨基转移酶和异构酶形成的酶对在催化k异亮氨酸形成 k别异亮氨酸或者催化k别异亮氨酸形成k异亮氨酸中的应用。
[0006] 本发明的氨基转移酶和异构酶形成的酶对在催化k异亮氨酸形成k别异亮氨酸 或者催化k别异亮氨酸形成k异亮氨酸中的应用，所述的氨基转移酶为氨基转移酶化aD 或氨基转移酶M化0,所述的异构酶为异构酶化址或异构酶M化H，所述的氨基转移酶化aD 的氨基酸序列如SEQIDNO. 7所示，所述的异构酶化址的氨基酸序列如SEQIDNO. 8所示， 所述的氨基转移酶M化0的氨基酸序列如SEQIDNO. 5所示，所述的异构酶M化H的氨基酸 序列如沈QIDNO. 6所示。
[0007] 优选，所述的氨基转移酶M化0的编码基因HrfnO基因的核巧酸序列如SEQIDNO. 1 所示。
[0008] 优选，所述的异构酶胞'nH的编码基因IirfnH基因的核巧酸序列如SEQIDNO. 2所 /J、-O
[0009] 优选，所述的氨基转移酶化aD的编码基因dsaD基因的核巧酸序列如SEQIDNO. 3 所示。
[0010] 优选，所述的异构酶化址的编码基因ds址基因的核巧酸序列如SEQIDNO. 4所 /J、-O W11] 本发明主要设及立方面的内容：一是利用生物信息学分析方法分别从desotamides和marformycins的生物合成基因簇中鉴定了参与kall〇-Ile生物合成的 氨基转移酶/异构酶一化aD/Ds址和版nO/M化H;二是通过体内基因敲除的方法，对氨 基转移酶/异构酶一化aD/Ds址和M化0/M化H进行体内缺失突变，获得生产含有L-Val 结构单元的化合物7,9和11 (图2)的高产菌株AnrfnH和S化巧tomycescoelicolor M1152/07-6H-DK0,Str巧tomycescoelicolorM1152/07-6H-EK0;S是本发明设及利用鉴 定的氨基转移酶/异构酶一化aD/Ds址和M化0/M化H在催化klle转化生成kallo-Ile中 的应用，其特点在于，L-allo-Ile的生成需要的两个酶协同作用，单独的氨基转移酶或者是 异构酶均不能催化kallo-Ile的生成，并且此催化过程不需要添加任何的辅因子。
[0012] 本发明通过观察比较kallo-Ile与L-Ile结构上的差别，发现的差别在0位 的碳原子上的甲基的构象不同，其中，L-Ile的0位的碳原子为3S型，而kallo-Ile的 0位的碳原子为3R型，因此本发明人推测kallo-Ile可能由L-Ile转化形成，此转化过 程能是氨基转移酶和异构酶两个酶分子协作完成两者之间的转变。首先是klle在氨基 转移酶的作用下，脱去氨基，变为幾基将a位碳原子固定在平面内，使其不能自由旋转。 其次在异构酶的作用下，完成P位的碳原子上甲基的翻转。本发明对desotamides和 marhrmycins生物合成基因簇中分别被注释为氨基转移酶的化aD和M化0进行了生物信 息学分析，多序列比对显示，化aD/M化0与已经报道的支链氨基酸转移酶化ranched-chain aminotransferase,BCATs)具有很高的序列同源性，并且具有与IV-型氨基酸转移酶相 同的特征基序"EXGXXNLFXnLXTXnLXGVXR"，W及具有与PLP共价相连的催化赖氨酸残基 化ysine)(如图3)，提示化aD/M化0具有PLP-依赖的氨基转移酶活性。本发明还利用对 蛋白进行结构同源性分析的在线资源皿pred分别对desotamides和marformycins的生 物合成基因簇中被注释为异构酶的化址和M化H进行了结构分析，显示其与属于核转运 因子2超家族（nucleartransport化Ctor2,NTF2)的蛋白具有类似的二级结构折叠方 式，核转运因子2超家族含有许多具有不同功能且彼此的氨基酸序列相似性很低的蛋白， 包括已报道的A5-3-酬类固醇异构酶（delta5-3-ketoste;roidisomerse)，其能够催化AS-3-酬固醇异构化生成A4-3-酬类固醇，本发明人推测desotamides基因簇中的化址 和marhrmycins基因簇中的M化H可能参与L-Ile的0碳原子上的甲基进行异构化生成 kallo-Ile。在marformycins和desotamides的生物合成基因簇中分别鉴定到可能参与 kallo-Ile合成的氨基转移酶/异构酶酶对（如图4)，提示kallo-Ile生物合成机制的 具有保守性。
[0013] 本发明设及在marformycins野生型产生菌Streptomyces化ozdowicziiSCSIO 10141中对氨基转移酶/异构酶M化0/M化H的基因进行敲除突变（如图5和6)，构建了 产生含有L-Val结构单元的化合物7的高产菌株AIrfnH。通过HPLC对突变株AIrfnO和 AIirfnH的发酵产物进行分析，发现AIirfnH完全不生产含有kallo-Ile结构单元的化合 物3和4,但产生含有L-Val结构单元的化合物5和7,且化合物7的产量与野生型菌株相 比提高约100倍左右（如图7);AIrfnO也完全不生产含有kallo-Ile结构单元的化合 物4(如图7)，但仍能产生含有L-Val结构单元的化合物5和7。运些数据证实了M化0/ M化H在合成kallo-Ile过程中的起到必不可少的作用，由于胞'nO/M化H的缺失突变，导 致前体kallo-Ile不能合成，因此，与kallo-Ile具有相似结构的kVal能够在合成 marhrmycin的过程中W毫无竞争的优势整合到marhrmycins肤链骨架中，从而获得产生 含有L-Val结构单元的化合物7的高产菌株AnrfnH。
[0014] 因此，本发明的第二个目的是提供一种高产化合物7的菌株AIrfnH，其特征在于， 所述的菌株AmfnH是将野生型Streptomyces化ozdowicziiSCSIO10141的mfnH基因进 行献除缺失突变而获得的； 阳〇1引所述的化合物7的结构式如式1所不,其中Ri=H,R2二CH3,R3二OH;
[0016]
或1。
[0017] 本发明还设及对desotamides基因簇中的氨基转移酶/异构酶--化aD/Ds址的 基因进行同框敲除突变（in-framedeletion),然后在异源宿主Steptomycescoelicolor M1152中进行表达（如图8和9)，构建了产生含L-Val结构单元的化合物9和10的 高产菌株Str巧tomycescoelicolorM1152/07-6H-EK0 和Str巧tomycescoelicolor M1152/07-6H-DK0。通过HPLC对StreptomycescoelicolorMl152/07-6H-邸0 和 StreptomycescoelicolorM1152/07-6H-DK0的发酵产物进行分析，发现dasE基因已经被 同框缺失突变的StreptomycescoelicolorM1152/07-6H-EK0完全不生产含有心曰11〇-116 结构单元的化合物8和10,但仍能生产含有L-Val结构单元的化合物9和11，且运两个化 合物的产量与对照菌株相比均大大提高（化合物9约100倍，化合物11约140倍左右） (如图10)。dsaD基因已经被同框缺失突变的异源表达菌株Streptomycescoelicolor M1152/07-6H-DK0虽然仍能产生含有kallo-Ile结构单元的化合物8和10,但其产量大大 降低，其仍能产生的含有L-Val结构单元的化合物9和11，且产量却大大提高（化合物9约 80倍；化合物11约50倍）（如图10)。运些数据也同样说明化aD/Ds址在合成心曰11〇-116 过程中的起到必不可少的作用。
[0018] 因此，本发明的第S个目的是提供一种高产化合物9和11的菌株Streptomyces coelicolorM1152/07-6H-EK0 或StreptomycescoelicolorM1152/07-6H-DK0,其特征在 于，所述的菌株StreptomycescoelicolorM1