一种羊草磷酸丙糖异构酶基因及其编码蛋白与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种羊草磷酸丙糖异构酶基因及其编码蛋白 与应用。
【背景技术】
[0002] 全球范围内作物的减产主要是由盐碱、干旱、重金属毒害、极端温度等非生物胁迫 因子所致。所有这些逆境胁迫都会引发机体代谢的失衡，使细胞内累积过量的甲基乙二醛 (MG)和活性氧（ROS)，对植物造成次级氧化胁迫。关于抗氧化胁迫作用，过去更多地关注抗 氧化酶和非酶抗氧化剂对ROS的清除。然而，逆境胁迫下，机体内MG是ROS大量爆发的重 要原因，ROS和MG在体内的代谢途径、及其清除系统密切相关。MG为活性羰基类物质，生理 条件下，MG主要通过糖酵解、糖异生和光合作用中间物磷酸丙糖的非酶促降解产生。胁迫条 件下，糖代谢途径的平衡被打破，磷酸丙糖极不稳定，形成大量MG。MG能与蛋白质、脂质和 核酸互作，高浓度下，MG会使得机体中关键的抗氧化防护系统失活，对植物细胞产生极大的 毒害。同时，MG通过与蛋白质发生非酶促糖基化反应能够生成晚期糖基化终产物（AGEs)， 在这一过程中会大量生成活性氧自由基。因此，有效地降低逆境胁迫下形成的过量MG应当 是提高植物抗逆性最重要策略之一。
[0003] 磷酸丙糖异构酶（TPI)是糖代谢中催化3-磷酸甘油醛（GAP)和磷酸二羟丙酮 (DHAP)之间相互转化的一个酶，可通过直接或间接的方式参与生物体内的糖酵解、糖异生、 磷酸戊糖途径、脂肪酸的生物合成及光合作用中〇)2的固定等，在碳代谢中占有重要的位 置。TPI的活性降低会使DHAP的水平升高，DHAP会自发地转变成MG。因此分离TPI基因， 应用于作物的抗逆分子育种中，可通过降低逆境胁迫下过量MG的形成而提高植物的抗逆 性。
【发明内容】
[0004] 本发明目的是为了解决植物的抗逆性低的问题，而提供一种羊草磷酸丙糖异构酶 基因及其编码蛋白与应用。
[0005] 本发明羊草磷酸丙糖异构酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No :1所示。
[0006] 本发明羊草磷酸丙糖异构酶基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0007] 本发明羊草磷酸丙糖异构酶基因的应用：羊草磷酸丙糖异构酶基因导入目的植物 中培育出抗逆性增强的转基因植物。
[0008] 本发明从羊草中分离出磷酸丙糖异构酶基因，命名为LcTPI ;LcTPI基因由1053 个碱基组成，包含5'端非翻译区（1-77)、蛋白质编码区（78-836)和3'端非翻译区 (837-1053)。LcTPI基因的编码蛋白由253个氨基酸组成，分子量是26. 9KD，等电点是 5. 57。
[0009] 本发明提供的LcTPI基因，其表达受中性盐、碱性盐或PEG模拟干旱诱导，可以参 与羊草对多种逆境胁迫的响应，提高植物的抗逆性。LcTPI基因导入目的植物中培育出抗逆 性增强的转基因植物，这对于培育抗逆性特别是抗甲基乙二醛和NaCl提高的植物品种具 有重要意义，为采用基因工程技术提高植物的抗逆性奠定了物质基础。
【附图说明】
[0010] 图1是实施例步骤2进行PCR扩增得到的LcTPI的cDNA PCR产物的凝胶电泳图， 其中，泳道 M 为 DL2000DNA Marker (2000bp，lOOObp，750bp，500bp，250bp，IOObp)，泳道 1 和 2为保守区PCR扩增产物；
[0011] 图2是实施例步骤3得到的LcTPI的cDNA 3 '末端PCR产物的凝胶电泳图，其中， 泳道M为DL2000DNA Marker，泳道1和2为一轮PCR产物稀释50倍和100倍的PCR扩增产 物；
[0012] 图3是实施例步骤4得到的LcTPI的cDNA 5'末端PCR产物的凝胶电泳图，其中 泳道M为DL2000DNA Marker，泳道1和2为二轮PCR产物稀释50倍的PCR扩增产物；
[0013] 图4是实施例步骤5PCR扩增LcTPI基因全长cDNA的凝胶电泳图，其中泳道M为 DL2000DNA Marker，泳道1和2为PCR扩增产物；
[0014] 图5是实施例步骤6PCR扩增LcTPI基因开放读码框（ORF)的凝胶电泳图，其中， 泳道M为DL2000DNA Marker，泳道1为PCR扩增产物；
[0015] 图6是实施例中获得潮霉素抗性拟南芥转化苗的生长情况图；
[0016] 图7是实施例中野生型拟南芥和转LcTPI拟南芥阳性苗在MG胁迫和没有胁迫处 理的生长情况图，其中1表示野生型未胁迫植株的生长情况，2-4表示转基因植株未胁迫下 的生长情况，5表示野生型拟南芥经MG胁迫的生长情况，6-8表示转基因植株经MG胁迫的 生长情况；
[0017] 图8是实施例中野生型拟南芥和转LcTPI拟南芥在含150mMNaCl的1/2MS培养基 上生长情况图，其中1为野生型拟南芥，2为转LcTPI拟南芥在1/2MS加150mMNaCl培养基 上生长情况。
【具体实施方式】
[0018] 本发明技术方案不局限于以下所列举【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】间的 任意组合。
【具体实施方式】 [0019] 一：本实施方式羊草磷酸丙糖异构酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No : 1所示。
[0020] 本实施方式中羊草磷酸丙糖异构酶基因由1053个碱基组成，包含5'端非翻译区 (1-77)、蛋白质编码区（78-839)和3'端非翻译区（840-1053)。
[0021] 本实施方式羊草磷酸丙糖异构酶基因，按照以下方法得到的：
[0022] 一、利用RNA提取试剂盒提取羊草中的总RNA，利用TOYOBO ReverTra Ace- α -试 剂盒将之反转录成cDNA，通过如下引物，进行PCR扩增：
[0023] Fi，5' -CGGTGAAGTCAGTGCTGAGATGC-3' ；
[0024] R1Y -GCTCCACCAACGAGGAAACCATC-3' ；
[0025] 回收纯化PCR产物，得到LcTPI基因的保守区序列；
[0026] 二、将步骤一中羊草的总 RNA 利用 PrimeScript Reverse Transcriptase 试剂盒 将之反转录成 cDNA，采用引物 TPI3' RACE GSP，5' -GCGTTCCCTGGGTCATTCTTGG-3' 和通用引 物混合物UPM，进行第一轮PCR扩增；
[0027] PCR产物稀释50倍和100倍，采用引物TPI3' RACE NGSP， 5' -TGTCGGTGAGACTCTTGAGCAGCG-3'和通用引物NUP进行第二轮PCR扩增，回收纯化PCR产 物，得到羊草TPI基因的3'末端序列；
[0028] 三、将步骤一中羊草的总 RNA 利用 SMARTScribe? Reverse Transcriptase 试剂盒 将之反转录成 cDNA，采用引物 TPI5' RACE GSP，5' -GCTCCACCAACGAGGAAACCATC-3' 和通用引 物混合物UPM，进行第一轮PCR扩增；
[0029] PCR产物稀释10倍和50倍，采用引物TPI5' RACE NGSP， 5 ' -TGGCATGGACTTCCTGTGCCTG-3 '和通用引物NUP进行第二轮PCR扩增，回收纯化PCR产物； PCR 产物稀释 50 倍，采用引物 TPI5' RACE NNGSP5' -GACCTTCAAGCCCTGAGCGAGTGC-3' 和通用 引物NUP进行第三轮PCR扩增，回收纯化PCR产物，得到羊草TPI基因的5'末端序列；
[0030] 四、将LcTPI基因的保守区序列、羊草TPI基因的3'末端序列和羊草TPI基因的 5'末端序列进行拼接，得到LcTPI基因的全长cDNA序列。
【具体实施方式】 [0031] 二：本实施方式羊草磷酸丙糖异构酶基因的编码蛋白的氨基酸序列 如 SEQ ID No. 2 所示。
[0032] 本实施方式羊草磷酸丙糖异构酶基因的编码蛋白由253个氨基酸组成，分子量是 26. 9KD,等电点是5. 57。
【具体实施方式】 [0033] 三：本实施方式羊草磷酸丙糖异构酶基因的应用：羊草磷酸丙糖异 构酶基因导入目的植物中培育出抗逆性增强的转基因植物。
[0034] 本实施方式中目的植物为双子叶植物或单子叶植物；所述抗逆性为对NaCl和甲 基乙二醛的抗性。
[0035] 采用以下实施例验证本发明的有益效果：
[0036] 实施例：
[0037] 实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所使用的材料、试剂、 酶、感受态细胞何质粒等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0038] 羊草磷酸丙糖异构酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No :1所示；它由1053个碱基组 成，包含5'端非翻译区（1-77)、蛋白质编码区（78-839)和3'端非翻译区（840-1053)。
[0039] 羊草磷酸丙糖异构酶基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示；羊草磷 酸丙糖异构酶基因的编码蛋白由253个氨基酸组成，分子量是26. 9KD，等电点是5. 57。
[0040] 上述羊草磷酸丙糖异构酶基因的获得及功能分析如下：
[0041] 一、LcTPI基因的获得
[0042] 1.羊草总RNA提取
[0043] 以羊草叶片（从吉林省长岭县腰井子草原移栽于哈尔滨师范大学农园）为 材料，使用RNAiso Plus(Code No. :9109)提取试剂盒，参照说明书提取其总RNA，根据 Recombinant DNase I (RNase-free) (Code No. :2270A)说明书消化DNA，进行 1.2%琼脂糖 凝胶电泳检测其完整性，并使用Gene SpecV快速核酸/蛋白分析仪检测其纯度及浓度，放 于-80°C冰箱中保存。
[0044] 2. LcTPI基因保守区的克隆
[0045] 以上述步骤1提取的总RNA为模板，用TOYOBO ReverTra Ace- α -试剂盒（Code No. :FSK-101，东洋纺公司）并参照试剂盒说明书的要求，反转录合成其cDNA第一链。在 NCBI中搜集羊草近缘物种的TPI基因序列，在保守位置设计引物FjP R1。用引物FjP Ri 进行PCR扩增得到LcTPI基因的保守区序列。
[0046] 其中引物如下！F1 (Lot No 8402640253) :5' -CGGTGAAGTCAGTGCTGAGA