I基因的全长cDNA序列。根据拼接的LcTPI基 因全长cDNA序列设计如下引物：
[0067] F2-2 (Lot No 8405326348) :5' -ACGCGGGGACCACCAAATC-3'
[0068] R2 (Lot No 8405326349)5'-CCCGGCCTTAGAGGAGCTAAACGTTATTGC-3'
[0069] 以上述步骤1提取的总RNA经反转录合成的第一链cDNA为模板，进行PCR扩 增。PCR 反应体系 10μ1，包括(IdH2O 7.02yl，10Xbuffer lyl，dNTPs(2.5mM)0.8yl， F2_2(10yM)0.3yl，R2(10yM)0.3yl，LaTaq(5U/yl)0.08yl，cDNA 0·5μ1。PCR 反应条 件：94°C 3min ;94°C 30s，59°C 30s，72°C lmin，30 个循环；72°C lOmin。对 PCR 扩增的产物 进行I %琼脂糖凝胶电泳，结果如图4所示。其中，泳道M为DL2000DNA Marker，泳道I和2 为PCR产物。结果表明，经PCR扩增获得了长度大约为1000 bp的目的片段。回收纯化PCR 产物，将其连接到PMD18-T载体上，转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，选取单菌落进行菌落 PCR鉴定。选出阳性菌落摇菌后测序。测序结果表明，该PCR扩增产物与上述拼接得到的序 列相同，PCR扩增产物序列长度1053bp，表明所克隆的3'末端片段、保守区片段和5'末端 片段属于同一个基因，获得了羊草LcTPI基因全长cDNA。
[0070] 6.羊草LcTPI基因 ORF区的克隆
[0071] 使用NCBI中的ORF Finder功能找到LcTPI基因全长序列中的ORF位置，在LcTPI 基因的ORF区两端外侧设计引物匕和R 3。
[0072] F3 (Lot No 8403489206)5'-AATCCGATCTGCTCCTCGTC-3'
[0073] R3 (Lot No 8403489207)5'-GTCTCTTCATCTTCGCTGTC-3'
[0074] 以上述步骤1提取的总RNA经反转录合成的第一链cDNA为模板，进行PCR扩 增。PCR 反应体系 10μ1，包括(IdH2O 7.02yl，10Xbuffer lyl，dNTPs(2.5mM)0.8yl， F3(10yM)0.3yl，R3(10yM)0.3yl，Taq(5U/yl)0.08yl，cDNA 0·5μ1。PCR 反应条件： 94。〇3111丨11;94。〇3〇8,53。〇3〇8,72。〇458,30个循环；72。〇1〇11^11。
[0075] 对PCR扩增的产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳，结果如图5所示。其中，泳道M为 DL2000DNA Marker，泳道1为PCR产物。回收纯化PCR产物，将其连接到PMD18-T载体上， 转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，选取单菌落进行菌落PCR鉴定。选出阳性菌落摇菌后测 序。测序结果表明，扩增得到842bp片段，LcTPI基因 ORF区由762bp的核苷酸序列组成， 编码253个氨基酸组成的蛋白质。该PCR扩增产物与上述LcTPI基因全长cDNA扩增的ORF 序列一致，进一步证实扩增获得羊草的LcTPI基因。
[0076] 二、转LcTPI基因拟南芥植株的抗逆性分析
[0077] I. LcTPI植物表达载体构建
[0078] 用Primescript反转录羊草RNA得cDNA，以TOM上和TOM下为引物对LcTPI的编码 区进行PCR扩增。引物序列如下：
[0079] TOM 上（Lot No 8404829418) ：5? -AGATCTAATCCGATCTGCTCCTCGTC-3' (下划线为 Bgl II位点）
[0080] TOM 下（Lot No 8404829419) ：5? -GGTCACCGTCTCTTCATCTTCGCTGTC-3' (下划线为 BstE II 位点）
[0081] 用1 %琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，将其克隆到pMD18-T载体并测序分析，证明 质粒构建正确，命名为pT-LcTPI。用限制性内切酶Bgl II /BstE II分别双酶切pT-LcTPI 重组质粒和植物表达载体PCAMBIA1304,分别回收855bp和9794bp大小的目的片段。将胶 回收得到的目的片段连接，连接反应体系：CldH2O 1 μ 1，Buffer 1 μ 1，ρ1304片段6.5 μ 1， LcTPI目的基因1 μ 1，T4DNA连接酶0. 5 μ 1。16°C连接10h。将重组质粒转化到DH5 α中， 菌落PCR鉴定为阳性的单菌落液体培养后，提取质粒，使用Xho I酶切鉴定。Xho I单酶切 反应体系：(IdH2O 39 μ 1，Xho I (10U/μ 1)3 μ 1，10XH buffer 6 μ 1，质粒 12 μ 1。37°C水 浴反应4h。酶切结果证明得到LcTPI基因表达载体质粒，将其命名为pl304-LcTPI。
[0082] 2.农杆菌蘸花法转化拟南芥
[0083] 植株培养：将Columbia生态型拟南芥种子播种于基质中（土壤：草炭：輕石= 1: 1:1)，置于16h/8h光暗周期，25°C的培养室中培养。当拟南芥抽苔至茎高5cm左右时，将 主茎剪掉，使其长出更多的侧枝，待其生长到只有个别开花，大多为花蕾时，对其浇足够的 水，将已结的荚去除后用于转化。
[0084] 重组载体转入农杆菌：将pl304-LcTPI通过冻融法转化农杆菌GV301感受态细 胞，涂布于Kan (终浓度为50 μ g/ml)和Rif (终浓度为50 μ g/ml)的YEP固体平板上， 28°C培养24-36h。菌落PCR鉴定转化体。挑阳性菌落在含有Kan (终浓度为50 μ g/ml)和 Rif (终浓度为50 μ g/ml)的YEP液体培养基中，28°C，160rpm振荡培养24h。
[0085] 制备转化液、转化：将200 μ 1菌液加到2ml含有Kan (终浓度为50 μ g/ml)和 Rif (终浓度为50 μ g/ml)及Gen (终浓度为25 μ g/ml)的YEP液体培养基中活化22h。将活 化菌液2ml加入40ml含Kan (终浓度为50 μ g/ml)和Rif (终浓度为50 μ g/ml)及Gen (终 浓度为25 μ g/ml)的YEP液体培养基中扩大培养至006(|(|约1. 6。5000rpm离心10min。加 5%蔗糖重悬，使OD6tltl约为0. 8。在转化前加入silwet L-77(使其终浓度为0. 05% )，混 匀。用移液器吸取上述制备好的转化液，轻轻滴加于拟南芥的花、花蕾及可长出侧枝的叶腋 处。在一周内进行第二次转化。转化后的植株正常管理，收获种子。
[0086] 3.阳性转化体筛选和抗逆性分析
[0087] 将收集的转化的种子，在含有潮霉素（终浓度为50 μ g/ml)和Timentin (终浓 度为200 μ g/ml)抗生素的1/2MS平板上播种，置于4°C 2天，移到植物培养箱（Percival E-36L)中（22°C，16h光照-8h黑暗的光周期）培养，进行抗性筛选。结果转基因抗性苗能 够正常生长，长出4片真叶时，非转基因苗仅能长出2片子叶，其根生长也受到严重抑制，逐 渐黄化死亡。生长状态如图6所示。对转基因拟南芥抗性苗取叶片用CTAB法提DNA，使用 &和R3引物，进行PCR鉴定检测，证实LcTPI基因转入拟南芥。
[0088] 将培养基中转基因阳性苗和同样状态的野生型对照移苗到蛭石中培养。缓苗5天 后，将转基因阳性苗和野生型拟南芥对照苗，每日每个育苗盒50ml浇灌0. 5mM甲基乙二醛 (MG);连续处理3天后，使用2mM甲基乙二醛（MG)再连续胁迫处理4天。在胁迫处理的同 时设置转基因阳性苗和野生型拟南芥对照苗浇灌50ml蒸馏水作为没有处理的对照。结果 胁迫处理结束后5天，转LcTPI拟南芥苗经胁迫处理的与未用MG处理的相比，生长状态没 有明显变化；而野生型拟南芥经MG胁迫处理的与未经胁迫处理的比，植株生长变缓，叶片 发生皱缩，并且出现失绿现象，生长情况如图7所示（1表示野生型未胁迫植株的生长情况， 2-4表示转基因植株未胁迫下的生长情况，5表示野生型拟南芥经MG胁迫的生长情况，6-8 表示转基因植株经MG胁迫的生长情况）。
[0089] 将野生型拟南芥种子和转基因阳性株收获的种子分别播种在1/2MS培养基和含 潮霉素（终浓度为SOμg/ml)的1/2MS培养基上，置于4°C2天，移到植物培养箱中两周后， 选择生长状态一致的幼苗移植到1/2MS、1/2MS加150mMNaCl的培养基中。4天后，NaCl胁 迫下的野生型拟南芥表现出明显的失绿、变黄化，而转基因植株叶色正常，生长情况如图8 所示（1为野生型拟南芥，2为转LcTPI拟南芥在1/2MS加150mMNaCl培养基上生长情况）。 实验证明转LcTPI拟南芥比野生型植株表现出更强的抗甲基乙二醛和NaCl的能力。
【主权项】
1. 羊草磷酸丙糖异构酶基因，其特征在于该基因的核苷酸序列如SEQ ID No :1所示。2. 羊草磷酸丙糖异构酶基因的编码蛋白，其特征在于该基因编码蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID No. 2 所示。3. 羊草磷酸丙糖异构酶基因的应用，其特征在于羊草磷酸丙糖异构酶基因导入目的植 物中培育出抗逆性增强的转基因植物。
【专利摘要】一种羊草磷酸丙糖异构酶基因及其编码蛋白与应用，它涉及生物技术领域。它要解决植物的抗逆性低的问题。羊草磷酸丙糖异构酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。羊草磷酸丙糖异构酶基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。应用：羊草磷酸丙糖异构酶基因导入目的植物中培育出抗逆性增强的转基因植物。本发明提供的LcTPI基因，其表达受中性盐、碱性盐或PEG模拟干旱诱导，可以参与羊草对多种逆境胁迫的响应，提高植物的抗逆性。LcTPI基因导入目的植物中培育出抗逆性增强的转基因植物，对于培育抗逆性特别是抗甲基乙二醛和NaCl提高的植物品种具有重要意义，为采用基因工程技术提高植物的抗逆性奠定了物质基础。
【IPC分类】C12N9/90, C12N15/82, A01H5/00, C12N15/61
【公开号】CN104975035
【申请号】CN201510423530
【发明人】崔继哲, 刘欣, 卢倩, 赵春梅, 李若男, 张宝懿, 孟雪
【申请人】哈尔滨师范大学
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2015年7月17日