一种芒草wrky转录因子在提高植物纤维生物量中的应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及芒草WRKY类转录因子MlWRKYl2及其编码基因与应用，属于植物基因工程技术领域。
【背景技术】
[0002]芒草(Miscanthus)是一类具有根状莖的多年生C4植物，多分布于热带至亚洲的东南部，是一种开发潜力巨大的纤维类能源植物，南荻(M.1utar1riparia)是我国特有的、在长江流域广泛分布的高生物产量纤维型多年生能源植物，具有重要的用途，其基因组序列与甜高粱具有较高的序列相似性。
[0003]植物的次生细胞壁是木质纤维素生物质的重要来源，它们也为人类生存提供织物、木材和潜在的第二代生物能源。参与细胞壁(即纤维素、半纤维素和木质素)合成的NAC和MYB转录因子在不同物种中都有深入研究，近来发现的拟南芥WRKY转录因子被证明参与髓薄壁细胞的次生细胞壁形成相关，可显著提高植物生物量。WRKY类蛋白共同特点是至少含有一个高度保守的WRKY结构域(WRKYGQK)和C2H2或C2HC的锌指结构。这类蛋白的WRKY结构域通过结合靶基因启动子区域的W盒(T)TGACC(A/T)核苷酸序列而调控相应基因的表达，发挥其重要的生物学功能。研究表明，WRKY蛋白参与植物病菌信号转导、植物衰老、生长发育和非生物逆境等众多生理过程。
[0004]植物开花是高等植物由营养生长向生殖生长的转变过程，是个体发育和后代繁衍的中心环节。这一发育的转变是植物体自身的发育条件和外部环境因素共同决定的。此外，开花时间是在提高生物能源作物的一个重要特征，因为延迟开花可以增加营养生长时间，从而达到提高纤维生物质产量的潜力。
[0005]目前对芒草WRKY转录因子的研究尚处于空白，特别是对其调控的遗传和分子机制还几乎一无所知。借助拟南芥模式体系，挖掘芒草WRKY家族中调节植物细胞壁增厚及调控植物花期的重要基因资源，对于植物的遗传改良上具有重要的意义。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供芒草转录因子#7rMT7J?基因的序列及功能，并进一步公开了该基因的应用。
[0007]本发明所提供的芒草WRKY类转录因子，命名为M1WRKY12,来源于芒属植物南荻(.Miscanthus 7wiar1ri/7ariw5.),是具有下述(I)至(3)中任一项所述的核苷酸序列:
(O具有序列表中SEQ ID N0.1的核苷酸序列；
(2)具有编码序列表中SEQID N0.2的蛋白质序列的多核苷酸；
(3)具有与序列表中SEQID N0.1的DNA序列较高同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
(4)其中，序列表中的SEQID N0.1由702个碱基组成，编码一个完整的开放阅读框，编码具有序列表SEQ ID N0.2的氣基酸残基序列的蛋白质。上述编码基因均具有序列表中SEQ ID N0.1的核苷酸序列。
[0008]上述芒草WRKY转录因子的编码基因MlWRKYl2为如下(I)至(3)是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质:
(O由序列表中的SEQ ID N0.2氨基酸残基序列组成的蛋白质；
(2)将序列表中的SEQID N0.1氨基酸残基序列经过一至多个氨基酸残基经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而形成的具有同等功能的衍生蛋白质；
(3)其中，序列表中的SEQID N0.2由233个氨基酸残基组成。
[0009]同时，本发明还包含上述芒草WRKY转录因子在改变植物生物量、调控植物开花中的应用，及含有本发明基因的表达载体，转基因植株、重组菌及宿主菌均属于本发明的保护范围。
[0010]扩增M/zmrn之中任一片段的引物也在本发明的保护范围之内。
[0011]本发明还包括所述植物转录因子蛋白的亚细胞定位分析。
[0012]本发明还包括所述植物转录因子蛋白的应用，包括将含有所述的WRKY蛋白的编码基因的表达载体转入拟南芥等其他植物，增强或抑制WRKY蛋白的表达从而调节植物细胞壁的组成，提高或降低生物量，调控开花时间等。
【附图说明】
[0013]图1 MlWRKYl2与其他物种WRKY家族转录因子保守区的氨基酸序列同源性比对。
[0014]图2 WRKY转录因子氨基酸序列比对后的进化树。
[0015]图3 M1WRKY12蛋白亚细胞定位图。
[0016]图4 M1VRKY12的表达模式分析。
[0017]图5 MlWRKYl2恢复拟南芥J tVRKY12的突变表型。
[0018]图6 MlWRKYl2促进拟南芥早花现象。
【具体实施方式】
[0019]下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容。
[0020]本发明实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
[0021 ] 实施例1芒草WRKY家族基因MlWRKYl2的获得。
[0022]取在14h L/1Oh D光照、温度25°C、相对湿度60%的条件下培养4周左右的芒草茎段进行基因的克隆分离。利用Trizol法提取其总RNA，利用RT-PCR技术从芒草中分离
之基因的cNDA，其编码氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0023]本实施例设计的扩增芒草#7rMT7J?基因核心片段的特异性引物为:
正向引物:5’-ATGGAGGGAGGCCAGTTGAG-3’ (SEQ ID N0.3)
反向引物:5’-TCAGAAGGAGCTGAAGCAATC-3’ (SEQ ID N0.4)。
[0024]PCR产物与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞并测序。
[0025]实施例2之基因序列分析。
[0026]MlWRKYl2基因⑶S序列包含702个核苷酸序列和233个氨基酸序列，预测其分子量为25.7kDa,用DNAMAN软件分析了 M1WRKY12与其他拟南芥WRKY家族蛋白的同源性。分析结果表明#7rM77J?具有典型保守的C2H2的锌指结构修饰(图1)。使用MEGA软件建立了 MlWRKYl2同其它WRKY家族蛋白的系统发生树，结果表明MlWRKYl2属于WRKY-1Ic亚家族，与甜高粱Sb04g033240、穗短柄草&/厥《77￥，水稻flsrMOh拟南芥FMTZJ的亲缘关系最近。图2展不#7腸?Τ/J?蛋白的系统进化关系。
[0027]实施例3麗/厥《77之基因的亚细胞定位。
[0028]将去掉终止密码子的的的开放阅读框(ORF)与pB7FWG2载体进行连接，构建与GFP相融合的载体，进行拟南芥转基因，对T2代转基因植株进行分析，表明该基因主要在细胞核内表达，如图3所示。
[0029]实施例4 M1WRKY12的表达模式分析。
[0030]在芒草盛花期，取其根〈root〉、地下茎〈Rhizome〉、基部茎〈stem(B) >、茎尖〈stem(U)〉、叶片〈leaf〉、叶鞘〈sheath〉、花序〈inflorescence〉等进行表达模式分析。利用Trizol法分别提取其总RNA，反转录得到第一链cDNA。利用qRT-PCR方法检测芒草
基因在这七个组织中的表达情况。基因用作为内参。如图4所示，结果表明，基因在地下茎和茎中的表达量较高。
[0031]本实施例设计的qRT-PCR基因核心片段的特异性引物为:
正向引物:5’-CGTGGATGTACTGGATGATGG-3’ (SEQ ID N0.5),
反向引物:5’-CGGAAATAGCTCCTTGGGTG-3’ (SEQ ID N0.6)。
[0032]本实施例设计的基因核心片段的特异性引物为:
正向引物:5’-TGACAGAAGCACCACTAAACCC-3’ (SEQ ID N0.7),
反向引物:5’-CCTGGATGGCGACATACATT-3’ (SEQ ID N0.8)。
[0033]实施例5芒草基因过表达载体的构建。
[0034]先将芒草#7柳沿7之基因全长cDNA连接到pGWC_T载体中，测序正确后，通过基因重组将其插入到Gateway载体pH2GW7中，从而得到含有#7rMT7J?基因的植物过表达载体。
[0035]实施例6在拟南芥的突变体中过量表达#7rMT7J?基因，恢复突变表型在拟南芥中基因缺失突变体表现为髓细胞壁增厚，将基因转化到拟南芥的突变体中。根据基因功能互补实验的结果表明，转化到突变体中饱M1WRKY12基因使髓细胞壁增厚并恢复到了野生型的水平，证明了 MlWRKYl2基因的生物学功能为与髓细胞壁加厚有关，确认了该基因即为与髓细胞壁形成相关的基因。
[0036]利用石蜡切片观察转基因拟南芥茎部次生壁的发育情况。具体步骤为:(I)材料的选取及固定:利用锋利刀片取植株0.2cm左右茎段，置于4%多聚甲醛固定液中真空抽气2h,直到材料沉于管底，4°C过夜。(2)脱水及透明:1倍PBS清洗一次，乙醇梯度脱水后，利用无水乙醇(A)和二甲苯(B)分别按照4作=3/1^作=1/1^作=1/3，8，8的比例渗透，每步Ih0 (3)浸蜡及包埋:利用二甲苯(B)和石蜡(C)按照8/0=3/1，8/^=1/1，8/^=1/3，(:，(:，〇的比例浸蜡，每步3h，62°C烘箱中进行。(4)切片、展片及烘片:利用LeicaRM2235切片机(Leica公司)将材料切成8 μ m的薄片，置于42°C水浴锅中展片f 2min，使之吸附于世泰REF188105粘附载玻片(世泰公司)上，37°C烘片2天。(5)脱蜡、二甲苯及染色:将附着有材料的载玻片置于二甲苯中脱蜡5min后，经A(无水乙醇)/B (二甲苯)=1/1，A, A, 95%A, 85%A, 75%A, 50%A, 30%A梯度脱于水中，最后在0.5% TBO染液中染色15s。(7)脱水及封片:将清水洗过的玻片依次在30%A，50%A, 75%A, 85%A, 95%A, A, A, B, B中脱水至二甲苯中，每步30s，随后利用加拿大树胶将其封存。(8)切片的观察:利用OLYMPUS DX51光学显微镜(Olympus公司)进行观察，拍照，如图5所示。
[0037]实施例7在植物中过量表达#7rMT7J?基因，促进转基因植株提前开花。
[0038]在#7rMT7J?的超表达植株中，植株表现出早花现象。进一步丰富了人们研究植物春化作用机理和成花过程的手段和内容，同时对于完善和推进植物春化作用机理的研究有着重要的意义。
【主权项】
1.芒草WRKY类转录因子全长cDNA，其特征在于: (1)SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列； (2)SEQID N0.1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸而形成的具有同等功能的核苷酸序列。2.权利要求1所述芒草WRKY类转录因子#7腸《77之基因全长cDNA编码的WRKY蛋白，其特征在于: (1)SEQID N0.2所示的氨基酸序列序列； (2)SEQID N0.2所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而形成的具有同等功能的蛋白序列。3.含有权利要求1所述的芒草WRKY类转录因子#7rMT7J?基因的植物表达载体。4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于所述的表达载体是将所述的WRKY转录因子蛋白基因M1WRKY12插入双元表达载体PB2GW7所得。5.含有权利要求1所述的芒草WRKY转職子MlWRKYl2基因的亚细胞定位重组载体。6.根据权利要求5所述的亚细胞定位载体，其特征在于所述的表达载体是将所述的WRKY转录浪子Μ1.ΚΥ12的CDS序列去掉终止密码子插入表达载体pB7FWG2所得。7.芒草MlWRKY转录因子蛋白基因#7厥《77之的基因工程应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述的芒草WRKY转录因子蛋白基因M1WRKY12在通过基因工程手段改变植物细胞壁的组成结构及调控开花时间，培育植物新品种中的应用。
【专利摘要】本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种从芒草（Miscanthus）中分离克隆得到的MIWRKY12基因与植物薄壁细胞增厚及开花调控相关的应用。其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。本发明可为提高植物生物量及调控植物花期提供可行方法。
【IPC分类】C07K14/415, C12N15/82, A01H5/00, C12N15/29
【公开号】CN104975028
【申请号】CN201410125344
【发明人】周功克, 贺郭, 于延冲, 胡瑞波, 王华美, 曹英萍, 付春祥
【申请人】中国科学院青岛生物能源与过程研究所
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2014年4月1日