小rna组成的指纹图谱在人卵巢癌诊断和治疗中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明公开了一种小RNA(miRNA ;microRNA)指纹图谱在卵巢癌诊断中的用途，属 于生物医学、生物工程和检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 卵巢恶性肿瘤是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，发病率仅次于子宫颈癌和子 宫体癌而列居第三位（Jemal等人；2011)。但卵巢上皮癌死亡率却占各类妇科肿瘤的首位， 对妇女生命造成严重威胁。由于卵巢的胚胎发育、组织解剖及内分泌功能较复杂，早期症 状不典型，术前鉴别卵巢肿瘤的组织类型及良恶性相当困难。卵巢恶性肿瘤中以上皮癌最 多见，约占卵巢癌的80%-90%(Chan等人；2006)，其次是恶性生殖细胞肿瘤。卵巢上皮癌患 者手术中发现肿瘤局限于卵巢的仅占30%，大多数已扩散到子宫，大网膜及盆腔各器官。由 于卵巢癌的早期症状不明显，鉴别其肿瘤良性、恶性很困难，只有20%的患者能够在进行早 期诊断出来，而近80%的患者就诊时已属晚期（Ahmed等人；1996、Etzioni等人；2003和 Wright 等人；2009)。
[0003] 在卵巢癌早期诊断中，CA-125是目前研究最深入、应用最广泛的血清肿瘤标志物， 也是普遍使用的早期诊断工具之一，但是此标志物特异性差，而且只能检测30%的早期卵 巢癌患者，所以早期诊断依然是卵巢癌的一大难题（Menon等人；2012)。
[0004] 近年来不断有文献报道miRNA在肿瘤诊断和治疗中的作用，卵巢癌特异性miRNA 的发现为其诊断和治疗打开了一个全新的局面。miRNA是一类内源性小分子非编码RNA，结 构高度保守，具有表达时序性和组织特异性，通过与靶基因3'非编码区（3'UTR)互补序列 特异性结合，导致翻译抑制或者mRNA降解，从而调苄基因表达（Bartel ;2004和Huang等 人；2010)。miRNA在恶性肿瘤中表达谱各异并发挥着重要的调控作用，随着大规模、高通量 miRNA检测技术的推广应用，发现新的miRNA不仅为肿瘤的诊断和预后提供了颇具价值的 标准，同时也为寻找新的肿瘤生物治疗祀标奠定了基础（Mezzanzanica等人；2010)。
[0005] miRNA的表达水平和肿瘤细胞的分化程度密切相关，而常规的mRNA标志物不具备 此特点。Bendoraite等人通过qPCR定量卵巢癌细胞中miR-200家族的表达，发现与在其余 癌症中报道的miR-200家族明显低表达不同，在卵巢癌细胞中呈现高表达趋势，通过软件 预测和3' UTR荧光素酶报告法发现其靶标为ZEBl和ZEB2,且进一步研究发现在卵巢癌发展 模式中，卵巢表皮细胞是先从间质到上皮的转移，这点也是与其他癌症是先从上皮转移到 间质过程相反（Bendoraite等人；2010)。ZEB转录因子是BMP信号通路的关键阻遏，Peart 等人发现BMP信号通路通过调节AKT酶的活性从而达到调控腹水诱导的人类卵巢表皮癌的 恶性程度（Peart等人；2012)。Li等人通过对人类转移性浆液性卵巢癌细胞SK0V-3ip和低 转移人浆液性卵巢癌细胞SK0V-3做miRNA表达谱芯片和荧光定量PCR验证，发现有多条差 异表达的miRNA，特别是miR-22对卵巢癌细胞的转移和侵袭有抑制作用（Li等人；2012)。 Xu等人还发现，过表达miR-182和miR-96靶标作用于FHB 03,对于调控卵巢癌细胞的增殖 起着显著作用（Xu等人；2013)。Wang和他的团队发现miR-182直接祀标负调节作用于卵 巢癌的肿瘤抑制子F1D⑶4 (Wang等人；2013)。Li等人的进一步研究发现，miR-183负调节 Tiaml的表达，从而促进卵巢癌细胞的迁移，侵袭和生长（Li等人；2012)。Stark等研究表 明，miRNA可以调节肿瘤形成，而且暗示其中的某些簇（如miR-17-92)可能是潜在的人类 原癌基因（Stark等人；2010)。
[0006] 上述这些发现可能会给药物设计和针对性治疗提供一个新的平台。而血清作 为肿瘤生物标记物，也是研究的热点。Li等人在2011年发现血清miRNA不受RNase、 环境、pH和低温影响的高度稳定性也使得肿瘤患者的实际值与实验所得结果大致一致 (Li等人；2012)。miR-21是最早发现的血清miRNA生物标记物。Taylor等人比较了良 性卵巢肿瘤血清和不同临床分期卵巢癌血清的外周血小体中miRNA表达谱。研究发现： miR-200, miR-21，miR-141等8条miRNA高表达，而在正常对照人群中未检测到其差异表达 (Taylor等人；2008)。因此，在外周血中这8条目标miRNA作为对无明显症状的卵巢癌患 者进行筛选，作为潜在的生物标记物。Resnick等人通过TaqMan?芯片法发现卵巢癌病人血 清中，21条差异表达的miRNA，进一步通过文献和定量结果发现:miR-21，miR-92，miR-29a， miR-126相对于在正常样本中而目，在卵巢癌血清中是显著1?表达的，而miR-155， miR-127，miR-99b则显著低表达，且还发现miR-21，miR-92，miR-93在生化指标CA125正常 的卵巢癌患者中显著高表达，反映了 miRNA可作为卵巢癌诊断的潜在生物标记物（Resnick 等人；2009)。
[0007] 尽管大量关于卵巢癌治疗的研究，卵巢癌仍难于诊断和有效治疗，患者中观测到 的死亡率表明疾病的诊断、治疗和预防需要改进。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供有效的小RNA指纹图谱，用于卵巢癌诊断、肿瘤分级和预 后评价。
[0009] 本发明的第一方面，提供一种分离的miRNA，所述的miRNA为：
[0010] ( i )序列如SEQ ID Ν0:η所示的miRNA，其中η为选自1-3的正整数；
[0011] ( ii )与 SEQ ID NO:η 所示序列互补的 miRNA ;
[0012] ( iii )序列如SEQ ID NO: 1-3所示的miRNA中的两种或两种以上的组合；或
[0013] ( iv )与SEQ ID NO: 1-3所示序列互补的miRNA中的两种或两种以上的组合。
[0014] 本发明的第二方面，提供一种miRNA集合或组合，所述miRNA集合或组合包含序列 如 SEQ ID NO: 1-3 所示的 3 种 miRNA。
[0015] 在另一优选例中，所述miRNA集合或组合由序列如SEQ ID N0:l-6所示的6种 miRNA所构成。
[0016] 在另一优选例中，所述miRNA集合或组合由序列如SEQ ID N0:l-10所示的10种 miRNA所构成。
[0017] 在另一优选例中，所述miRNA集合或组合为由十个小RNA (HSA-MIR-1271-5P、 HSA-MIR-574-3P、HSA-MIR-182-5P、HSA-MIR-183-5P、HSA-MIR-96-5P、HSA-MIR-15B-5P、 HSA-MIR-182-3P、HSA-MIR-141-5P、HSA-MIR-130B-5P 和 HSA-MIR-135B-3P)组成的小 RNA 指纹图谱，用于卵巢癌诊断、肿瘤分级和预后评价。
[0018] 在另一优选例中，所述miRNA集合或组合由序列如SEQ ID NO: 1-6和SEQ IDN0:11 所示的7种miRNA所构成。
[0019] 在另一优选例中，所述miRNA集合或组合为由七个小RNA (hsa-miR-182-5p、 hsa-miR-183-5p、hsa-miR-96-5p、hsa-miR-1271-5p、hsa-miR-182-3p、hsa-miR-1468-5p 和 hsa-miR-135b-3p)组成的小RNA指纹图谱，用于上皮性卵巢癌诊断、肿瘤分级和预后评价。
[0020] 在另一优选例中，所述的miRNA分离自人。
[0021] 在另一优选例中，所述的序列可通过化学合成或构建真核细胞表达载体进行表达 获得。
[0022] 在另一优选例中，所述miRNA集合或组合还包含序列如SEQ ID NO: 12-516所示的 miRNA中的两种或两种以上的组合。
[0023] 在另一优选例中，所述的miRNA集合或组合包括HSA-MIR-1271-5P、 HSA-MIR-574-3P、HSA-MIR-182-5P、HSA-MIR-183-5P、HSA-MIR-96-5P、HSA-MIR-15B-5P、 HSA-MIR-182-3P、HSA-MIR-141-5P、HSA-MIR-130B-5P 和 HSA-MIR-135B-3P 中的一种或两种 以上，用于区分卵巢癌组织和正常卵巢组织。
[0024] 在另一优选例中，HSA-MIR-1271-5P和HSA-MIR-574-3P在卵巢癌组织中表达下 调。
[0025] 在另一优选例中，所述的miRNA集合或组合包括hsa-miR-182_5p、 hsa-miR-183-5p、hsa-miR-96-5p、hsa-miR-1271-5p、hsa-miR-182-3p、hsa-miR-1468-5p 和 hsa-miR-135b-3p中的一种或两种以上，用于区分上皮性卵巢癌组织和正常卵巢组织。
[0026] 在另一优选例中，HSA-MIR-182-5P、HSA-MIR-183-5P、HSA-MIR-96-5P、 HSA-MIR-15B-5P、HSA-MIR-182-3P、HSA-MIR-141-5P、HSA-MIR-130B-5P 和 HSA-MIR-135B-3P 在卵巢癌组织中表达上调。
[0027] 在另一优选例中，所述的miRNA集合或组合包括425种在卵巢癌组织和正常卵 巢组织中表达倍数差异大于2的miRNA，其中204种上调（hsa-miR-522、hsa-miR-429、 hsa-miR-141_5P、hsa_miR-200a、hsa-miR-96_5P、hsa-miR-183_5P、hsa_miR-449c、 hsa-miR-205 和 hsa-miR-182-5P 最显著，差异倍数大于 10) ;221 种下调（hsa-miR-202-3p、 hsa-miR-4711-3p、hsa-miR-4778-5p、hsa-miR-4510、hsa-miR-4789-5p、hsa-miR-4760-3p、 hsa-miR-4804_5p，hsa-miR-4770、hsa-miR-4781_3p、hsa-miR-4738_5p、hsa-miR-4777_5p、 hsa-miR-4696和hsa-miR-4678最显著，差异倍数大于10);由此区分卵巢癌组织和正常卵 巢组织。
[0028] 在另一优选例中，所述的miRNA集合或组合包括489种在上皮性卵巢癌组 织和正常卵巢组织中表达倍数差异大于2的miRNA，其中241种上调（hsa-miR-522、 hsa-miR-429、 hsa-miR-96_5P、 hsa-miR-205、 hsa-miR-141_5P、 hsa-miR-183_5P、 hsa_miR-200a、 hsa-miR-182_5P、 hsa_miR-519a、 hsa_miR-200c、 hsa_miR-449c、 hsa-miR-182_3p、hsa-miR-135b_3p 和 hsa_miR-1274a 最显著，差异倍数大于 10); 248 种下调（hsa-miR-202_3p、hsa-miR-4778_5p、hsa-miR-4711_3p、hsa-miR-4510、 hsa-miR-4777-5p、hsa-miR-4738-5p、hsa-miR-4770、hsa-miR-4789-5p、hsa-miR-4804-5p、 hsa-miR-4696, hsa_miR-476〇-3p、hsa-miR-4781_3p、hsa-miR-4524_3p、hsa-miR-4759 和 hsa-miR-4719最显著，差异倍数大于10);由此区分上皮性卵巢癌组织和正常卵巢组织。
[0029] 本发明的第三方面，提供一种分离的或人工构建的前体miRNA，所述的前体miRNA 能在人细胞内剪切并表达成权利要求1所述的miRNA。
[0030] 本发明还提供一种分离的或人工构建的前体miRNA集合或组合，所述的前体 miRNA集合或组合中的前体miRNA能在人细胞内剪切并表达成第二方面所述的miRNA集合 或组合中的miRNA。
[0031] 本发