一种uplc测定穿心莲药材指纹图谱及四种二萜内酯的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种穿心莲药材的超高效液相指纹图谱及四种二萜内酯的检测方法， 属于药物分析技术领域。
【背景技术】
[0002] 穿心莲 Andrographispaniculata (Burm. f. ) Nees.为爵床科（Acanthaceae)穿心 莲属AndrographisWall. exNees.植物，又名一见喜、苦草、四方草、印度草等，主产于广东、 福建等地，干燥地上部分作为药用。《中国药典》2010年版一部记载其性寒、味苦，具有清热 解毒、凉血、消肿之功效，被广泛用于治疗细菌性痢疾、急性扁桃体炎、尿路感染、流行性感 冒和毒蛇咬伤等症。
[0003] 由于中药化学成分复杂，作用机制不明确，致使现有中药制药技术难以确保中药 产品质量稳定性，中药指纹图谱建立的可以全面反映中药内在化学成分的种类与数量，进 而反映中药的质量。现阶段中药的有效成分绝大多数没有明确，采用中药指纹图谱的方式， 将有效地表征中药质量。指纹图谱已为国际社会所认可，有利于中药及产品进入国际市场。
[0004] 穿心莲药材的真伪、内在质量对于后期制剂的工艺规范化控制和临床用药的有效 性、安全性和稳定性都具有非常重要的意义，所以寻找到一种比较好的穿心莲药材的鉴别 和穿心莲提取物含量的测定方法是极其具有价值的，而且采取多成分指标同时测定，也是 保证药材质量和确切疗效行之有效的方法。首先，本发明从鉴别穿心莲药材的方法入手，利 用超高效液相色谱法（UPLC)建立穿心莲药材的指纹图谱；并且同时测定了穿心莲内酯、脱 水穿心莲内酯、新穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯四个穿心莲主要二萜内酯类成分的含量。本 发明通过对超高效液相色谱法的提取溶剂、提取时间、提取方式、色谱柱、流动相、梯度洗脱 程序以及检测波长等色谱条件进行多方面考察，找到了一种更加准确、快速、灵敏度高、重 复性好的鉴定穿心莲药材以及有效成分含量测定的方法。
[0005] 目前，现有技术中有对穿心莲提取物进行指纹图谱研究的报道，但采用4种参比 物，最终只鉴定出7个共有峰，操作相对复杂，而精密度较差。本发明人有针对性的对这些 缺点进行了研究，建立了一种新的标准指纹图谱，利用该图谱对穿心莲药材进行质量监督， 以确保产品质量。采用本发明的方法，提取时间短，不需减压干燥，可防止有效成分变性。且 色谱峰形和分离度得到了极大的改善。与现有文献选择了 7个指纹峰比较，本发明中选取 了更多的指纹峰，使得药材质量控制的准确性得到了很大的提高。
【发明内容】
[0006] 本发明提供一种穿心莲超高效液相标准对照指纹图谱，其建立方法如下：
[0007] 1)供试品洛液制备：
[0008] 取穿心莲，采用甲醇水溶液进行提取，再加入甲醇水溶液调整溶液浓度，滤过，取 滤液，既得；
[0009] 2)获得色谱图：
[0010] 配制穿心莲内酯溶液作为参照物，将供试品溶液和穿心莲内酯溶液注入超高效液 相色谱仪，得到色谱图；
[0011] 3)生成对照指纹图谱
[0012] 选择合格的多批穿心莲样品的指纹图谱，以穿心莲内酯峰为参比峰，得到27个共 有峰的图谱，用软件，例如"中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统3. 0"（文献：张 宇，孙国祥，焦宝明等。冠心苏合丸高效液相色谱数字化定量指纹图谱研究[J].中南药学， 2013, 11 (1).)，按平均值法计算生成标准对照指纹图谱。
[0013] 其中，色谱条件如下：采用 Acquity UPLC BEH C18 色谱柱（L 7μπι，2· lXIOOmm); 梯度洗脱；流动相A为0. 2% -0. 4%甲酸-水溶液，流动相B为甲醇：乙腈=1 :9~2 :8 混合溶液；进样量为1-3 μ L ;色谱柱温度20°C -30°C ;以穿心莲内酯为参照物，检测波长为 247_251nm ;
[0014] 其中梯度洗脱程序如下所示：0~2min，88%~82%- 80%~74% B ;2~3min， 80%~74% B ;3 ~5min，80%~74%- 79%~73% B ;5 ~7min，79%~73%- 78%~ 72% B ;7 ~7. 5min，78%~72%- 72%~66% B ;7· 5 ~8min，72%~66% B ;8 ~9min， 72%~66%-68%~62%B ;9 ~llmin，68%~62%-63%~57%B ;11 ~12min，63%~ 57%-61%~55%B;12~13min,61%~55%B;13~15min,61%~55%-38%~32% B ;15 ~17min，38%~32%- 23%~17% B ;17 ~19min，23%~17%- 88%~82% B ; 19 ~21min,88%~82% B。
[0015] 优选的本发明所述的标准对照指纹图谱，其建立方法如下：
[0016] 1)供试品溶液的制备，方法如下：
[0017] 精密称定穿心莲药材粉末，加入20-200倍量（重量体积比）60-80%甲醇-水溶液 超声提取20-60min，超声后，放置至室温，用60-80%甲醇-水溶液据体积定容，0. 22 μ m微 孔滤膜滤过，取续滤液，即得；
[0018] 2)以穿心莲内酯作为参照物制备标准对照品溶液，方法如下：
[0019] 精密称取穿心莲内酯对照品适量，加60-80%甲醇-水溶解制成0. 5~1. 5mg/ml 的溶液，即得；
[0020] 3)标准对照指纹图谱的确定，方法如下：
[0021] 将供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪，得到色谱图，
[0022] 多批穿心莲样品的指纹图谱中共有27个峰为共有峰，计算27个共有指纹峰的相 对保留时间和相对保留时间的RSD值，将积分信号导入"中药色谱指纹图谱超信息特征数 字化评价系统3. 0"软件，按平均值法计算生成标准对照指纹图谱，其中，与穿心莲内酯对照 品峰保留时间相同的色谱峰为17号峰；
[0023] 其中，色谱条件如下：采用 Acquity UPLC BEH C18 色谱柱（1. 7μπι，2· lXIOOmm); 梯度洗脱；流动相A为0. 3%甲酸-水溶液，流动相B为甲醇：乙腈=1 :9的混合溶液；进样 量为2μ L ;色谱柱温度25°C ;以穿心莲内酯为参照物，检测波长为249nm ;
[0024] 其中梯度洗脱程序如下所示：0~2min，85%- 77% B ;2~3min，77% B ;3~ 5min，77 % - 76 % B ;5 ~7min，76 % - 75 % B ;7 ~7. 5min，75 % - 69 % B ;7· 5 ~8min， 69% B ;8 ~9min,69%- 65% B ;9 ~llmin,65%- 60% B ;11 ~12min,60%- 58% B ; 12 ~13min,58% B ;13 ~15min,58%- 35% B ;15 ~17min,35%- 20% B ;17 ~19min， 20%- 85% B ;19 ~21min,85% B。
[0025] 最优选的，本发明所述的标准对照指纹图谱，其建立方法如下：
[0026] 其中步骤1)供试品溶液的制备，方法如下：
[0027] 精密称定穿心莲药材粉末，加入重量体积比为50倍量的80%甲醇-水溶液超声提 取20min,超声后，放置至室温，用80 %甲醇-水溶液据体积定容，用0.22 μ m微孔滤膜滤 过，取续滤液，即得。
[0028] 2)以穿心莲内酯作为参照物制备标准对照品溶液，方法如下：
[0029] 精密称取穿心莲内酯对照品适量，加80%甲醇-水溶解制成lmg/ml的溶液，即得。
[0030] 本发明还提供一种穿心莲的超高效液相色谱指纹图谱检测方法，其特征在于，包 括如下步骤：
[0031] 1)待测样品色谱图的制备：
[0032] 取穿心莲，采用甲醇水溶液进行提取，再加入甲醇水溶液调整溶液浓度，滤过，取 滤液，注入超高效液相色谱仪，得到色谱图；
[0033] 2)待测样品色谱图和标准对照指纹图谱相似度计算：
[0034] 将待测样品的色谱图导入"中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统3. 0"软 件，比较待测样品的色谱图和标准对照指纹图谱相似度；
[0035] 其中，色谱条件如下：采用 Acquity UPLC BEH C18 色谱柱（1. 7μπι，2· lXIOOmm); 梯度洗脱；流动相A为0. 2% -0. 4%甲酸-水溶液，流动相B为甲醇：乙腈=1 :9~2 :8 混合溶液；进样量为1-3 μ L ;色谱柱温度20°C -30°C ;以穿心莲内酯为参照物，检测波长为 247_251nm ;
[0036] 其中梯度洗脱程序如下所示：0~2min，88%~82%- 80%~74% B ;2~3min， 80%~74% B ;3 ~5min，80%~74%- 79%~73% B ;5 ~7min，79%~73%- 78%~ 72% B ;7 ~7. 5min，78%~72%- 72%~66% B ;7· 5 ~8min，72%~66% B ;8 ~9min， 72%~66%-68%~62%B ;9 ~llmin，68%~62%-63%~57%B ;11 ~12min，63%~ 57%-61%~55%B;12~13min,61%~55%B;13~15min,61%~55%-38%~32% B ;15 ~17min，38%~32%- 23%~17% B ;17 ~19min，23%~17%- 88%~82% B ; 19 ~21min,88%~82% B。
[0037] 优选的，本发明指纹图谱检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0038] 1)待测样品色谱图的制备：
[0039] 精密称定穿心莲药材粉末，加入20-200倍量（重量体积比）60-80%甲醇-水溶液 超声提取20-60min，超声后，放置至室温，用60-80%甲醇-水溶液据体积定容，微孔滤膜滤 过，取续滤液，注入高效液相色谱仪，得到色谱图；
[0040] 2)待测样品色谱图和标准对照指纹图谱相似度计算：
[0041] 将待测样品的色谱图导入"中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统3. 0"软 件，比较待测样品的色谱图和标准对照指纹图谱相似度：相似度为0. 90以上为合格，相似 度为0. 95以上为相符。
[0042] 其中，色谱条件如下：采用 Acquity UPLC BEH C18 色谱柱（1. 7μπι，2· lXIOOmm); 梯度洗脱；流动相A为0. 3%甲酸-水溶液，流动相B为甲醇：乙腈=1 :9混合溶液；进样量 为2μ L ;色谱柱温度25°C ;以穿心莲内酯为参照物，检测波长为249nm ;
[0043] 其中优选的梯度洗脱程序如下所示：0~2min，85% - 77% B ;2~3min，77% B ; 3 ~5min，77%-76%B ;5 ~7min，76%-75%B ;7 ~7. 5min，75%-69%Β ;7· 5 ~8min， 69% B ;8 ~9min,69% - 65% B ;9 ~llmin,65% - 60% B ;11 ~12min,60% - 58% B ; 12 ~13min,58% B ;13 ~15min,58%- 35% B ;15 ~17min,35%- 20% B ;17 ~19min， 20%- 85% B ;19 ~21min,85% B。
[0044] 最优选的，本发明所述的指纹图谱检测方法，其中，
[0045] 步骤1)供试品溶液的制备，方法如下：
[0046] 精密称定穿心莲药材粉末，加入重量体积比为50倍量的80%甲醇-水溶液超声 提取20min,超声后，放置至室温，用80%甲醇-水溶液据