胃癌脾虚证唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法

胃癌脾虚证唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法
【专利摘要】本发明公开了一种胃癌脾虚证唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法，包括以下步骤：样品收集；纳米磁珠预处理；样品预处理；唾液样品洗脱上样；质谱分析；数据采集；数据分析；建立诊断模型。本发明运用WCX与MALDI?TOF?MS蛋白质组学技术，基于唾液蛋白质组开展胃癌脾虚证病证结合分子诊断研究，发现胃癌脾虚证与非脾虚证比较，有6个差异蛋白峰具有统计学意义。胃癌脾虚证与正常对照组对比，共有106个差异蛋白质峰有统计学意义，其中有101个蛋白峰差异具有非常显著性意义，其中，26个质峰在脾虚证组表达下调，80个质峰在脾虚证组表达上调。
【专利说明】
胃癌脾虚证唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法
技术领域
[0001 ]本发明属于蛋白质谱应用技术领域，具体地说，涉及一种胃癌脾虚证唾液蛋白指 纹图谱分子诊断模型建立方法。
【背景技术】
[0002] 胃癌为本虚标实之证，以痰凝、气滞、血瘀、邪热为标，脾虚为本]。脾胃虚弱是胃癌 发生、发展的基础，存在于胃癌前疾病-癌前病变-胃癌的整个过程。脾虚失运可致痰饮内 生，痰湿交阻易在局部结聚形成肿块，且痰饮随气流行，机体内外无所不至，以致肿瘤易于 复发、转移。江澄等对500例胃癌患者进行调查，结果显示胃癌手术前后单一证型以胃癌所 占的比率最多。赵群等根据中医辨证标准，将102例患者分为胃癌无脾虚证和有脾虚证两 组，分析统计脾虚证的有无与胃癌浸润深度、分化程度、淋巴结转移以及ΡΩ#分期等生物学 行为的关系，结果显示胃癌患者脾虚证与其临床生物学行为之间有密切的关系，脾虚证患 者的预后比非脾虚证患者差。
[0003] 病证结合已经成为现代中西医结合临床的主要模式。鉴于不同疾病的特征性病理 实质不同，开展病证结合的证候诊断客观化研究是十分必要的。脾虚是中医临床最常见的 基本证候之一，也是胃癌的重要病机和常见证候。
[0004] 唾液检测的应用已广泛应用于感染性疾病、内分泌疾病等各系统疾病的研究，尤 其是在各系统肿瘤诊断、病情变化监测、临床分期、疗效监测等方面具有巨大的应用前景。 唾液中含有大量蛋白质，而蛋白质是生命活动的执行者和体现者，因而不同的疾病有蛋白 质组学水平上的差异。已有研究证明，唾液中含有HP(HP感染是胃炎、胃癌的重要病因 ）、HP 抗体IgG、硫酸还原菌（SRP)、KYNA(具有抗结肠癌作用）等180种生物标志物。质谱蛋白质组 学技术的发展促进了唾液生物标志物的探索进程。
[0005] 目前MALDI-T0F蛋白质组学技术已较多应用于胃癌的病因、诊断、治疗、预后以及 是否发生转移的判断等多方面的研究。Ding Y发现胃上皮AGS细胞癌变与EBV病毒感染有 关;Oya-Ito T通过该技术发现热休克蛋白27的翻译后修饰在胃肠肿瘤上皮细胞损伤的过 程中发挥着重要的作用;Repetto 0等发现胃癌与自身免疫性胃炎存在27个差异蛋白点；南 蛇藤可使胃癌患者HSP蛋白表达显著下调，而过度表达的HSP蛋白也可降低南蛇藤的疗效； Bal Iuf f B等研究发现HNP-I、S100-A6可进一步用来区分早期胃癌（UICC-I)和晚期胃癌 (UICC-II和III)，而CRIPl则为一个新型、有效且独立的肿瘤预后因子。ZhangF等发现 TRAKl/MGb2-Ag可作为诊断胃印戒细胞癌和粘液腺癌的生物标志物。与亲代细胞系相比，顺 铂耐药细胞系，PK_M2(丙酮酸激酶-M2)蛋白表达和活性水平均降低，而使用反义寡核苷酸 抑制PK-M2表达可进一步增加细胞对顺铂的耐药性。PAR-I-直参与胃肠道炎症、肿瘤细胞 生长和胃癌细胞的入侵，据研究，在华裔受试者中，PAR-IIVSn-HT等位基因的表达是发生 幽门螺旋杆菌相关型胃癌的风险因素之一，而PAR-1-506ins/del基因的多态性则没有参与 胃癌过程。胃癌患者胃癌组着和血衆中的AGP(alpha-l_acid glycoprotein)水平均表达增 高。胃癌患者15-PGDH与C0X-2表达承负相关，并与胃癌的??Μ分期、淋巴结转移密切相关。胃 癌组织中CLICl过度表达，实验证明，胃癌患者体内CLICl低表达者5年生存率明显高于高表 达者，因而CLICl可作为判断胃癌预后的重要分子。胃癌存在β-cat异常表达，检测β-cat的 表达可作为判断胃癌分化、浸润、转移和预后的良好参考指标。环氧化酶-2(C0X-2)和基质 金属蛋白酶-9(MMP_9)表达与胃癌的生物学行为密切相关。可作为反映胃癌浸润、转移和预 后的重要指标。
[0006] 因此，提供一种诊断模型简便、快速、标本用量少，灵敏度高，特异性好的胃癌脾虚 证唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型的建立方法，就成为该技术领域急需解决的技术难题。

【发明内容】

[0007] 有鉴于此，本发明所要解决现有方法对于胃癌脾虚证的诊断复杂，诊断时间长， 灵敏度低，特异性差的问题，提供了一种胃癌脾虚证唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立 方法。
[0008] 为了解决上述技术问题，本发明公开了一种胃癌脾虚证唾液蛋白指纹图谱分子诊 断模型建立方法，包括以下步骤：
[0009] (1)样品收集；
[0010] (2)纳米磁珠预处理；
[0011] (3)样品预处理:取出冷冻保存的唾液样品，冰上解冻，所有唾液样品均1次冻融， 取5μ1唾液样品加入?ομL的U9裂解液，混合孵育30min后，加入185μ1的Wash Buffer稀释（唾 液最终上样量为2.5μ1);
[0012] (4)唾液样品洗脱上样:③向每个装有纳米磁珠的PCR管中分别加入100μΙ预处理 后的唾液样品，混匀，置于室温孵育30min，将所述PCR管置于磁铁上孵育lmin，去除上清液； ④每管加入100μΙ的Wash Buffer洗脱5min，然后将所述PCR管置于磁铁上孵育Imin，去除上 清液;再重复步骤④操作一次，以洗脱更干净，获得较纯的目的蛋白；⑤在所述PCR管中加入 10μ1的Elution Buffer洗脱5min，将所述PCR管置于磁铁上孵育lmin，取5μ1上清液移至另 一个PCR管中；⑥将装有5μ1上清液的PCR管中加入5μ1的CHCA饱和溶液，充分混匀，至样品颜 色发灰，而没有明显的沉淀时，取2μ1混合溶液，加样到Au/Steel芯片上，晾干后放入仪器读 取；
[0013] (5)质谱分析:采用质谱仪读取所述Au/Steel芯片信息，设置激光强度为190,灵敏 度为5;
[0014] (6)数据采集；
[0015] (7)数据分析；
[0016] (8)建立诊断模型：用Biomarker Pattern Software 5.0.2采用决策树算法计算 出多个变量变化对两样本的判别价值，确定最佳的诊断模型。
[0017] 进一步的，所述步骤（1)样品收集的方法为：胃癌脾虚证组和正常对照组在取材前 一天晚上临睡前清水漱口，之后不再进食任何食物和药物，于第二天晨起后漱口前采用非 刺激性唾液采集方式空腹取材，前5min内的唾液自然吞下后开始收集，收集到的唾液置于 冰浴中的15ml唾液离心管内，4°C下静置Ih后，3000r/min、4°C下离心10min，冰浴上分装在 Iml的EP管中，每管200μ1，于-80 °C冰箱冷冻保存备用。
[0018] 进一步的，所述步骤(2)纳米磁珠预处理的方法为:①取WCX纳米磁珠50μ1加入到 200μ1的PCR管中，置于磁铁上孵育Imin，去除上清液;②再加入100μΙ的Wash Buffer洗脱 5min，在磁铁上孵育Imin，去除上清液;再重复步骤②操作一次，这样洗脱更干净，质谱检测 受到干扰的可能性会更少。
[0019] 进一步的，所述步骤(6)数据采集的方法为：用Ciphergen Proteinchip Software 3.2.1软件采集数据，纵坐标为峰强度，横坐标为蛋白质质荷比，收集数据的质荷比范围为 2000~25000m/z，信号收集位置40~60,平均每点收集20次，收集总点为100次，已知多肽标 准芯片标准，激光离子流0.5。
[0020] 进一步的，所述步骤（7)数据分析的方法为：对位于2000~25000m/z峰值，用 Biomarker Wizard软件过滤噪音;设置初始的噪音过滤值为5，二次信噪比为2，以10%为最 小阈值进行聚类，经上述数据预处理后，采用t检验比较所述胃癌脾虚证组和所述正常对照 组唾液蛋白质质谱数据，找出所述胃癌脾虚证组和所述正常对照组之间具有统计学意义的 差异表达蛋白质峰。
[0021] 进一步的，步骤(7)中，设置P<0.01，所述胃癌脾虚证组和所述正常对照组之间具 有统计学意义的差异表达蛋白质峰有101个(P<〇.01)，其中所述胃癌脾虚证与所述正常对 照组比值比率>4的有17个差异蛋白，其中，有4个蛋白质峰在所述胃癌脾虚证组表达下调， 13个蛋白质峰在所述胃癌脾虚证组表达上调，所述17个差异蛋白具体如下：

[0024] 进一步的，步骤(6)所述荷质比范围为2000~15000m/z。
[0025] 与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
[0026] 1)本发明运用WCX与MALDI-T0F-MS蛋白质组学技术，基于唾液蛋白质组开展胃癌 脾虚证病证结合分子诊断研究，发现胃癌脾虚证与非脾虚证比较，有6个差异蛋白峰具有统 计学意义(P<〇.〇5)，其中有2个差异蛋白峰(m/z分别为5439.67、5380.16)具有非常显著意 义（P<0 · 01)。经Biomarker Patterns 5 · 0 · 2诊断模型软件筛选出m/z为5439 · 67、2411 ·67、 3619.18等3个差异蛋白质峰建立胃癌脾虚证与正常对照组的诊断判别模型。经临床回代检 验，该模型的灵敏度和特异度分别达100% (40/40)和93% (42/45);通过交叉验证法进一步 验证诊断模型的可靠性，结果该模型的灵敏度和特异度分别为87% (35/40)和89% (40/ 45)。说明该模型对胃癌脾虚证的诊断效率优良，灵敏度高、特异性强。
[0027] 2)本发明的研究结果已显示出良好的应用前景，值得进一步深入研究并在临床推 广转化。
[0028] 当然，实施本发明的任一产品必不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
【附图说明】
[0029] 此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发 明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
[0030] 图1为本发明实施例中胃癌脾虚证组与正常对照组蛋白质代表性图谱；
[0031] 图2为本发明实施例中胃癌脾虚证组与胃癌非脾虚证组蛋白质代表性图谱；
[0032] 图3为本发明实施例中胃癌脾虚证组与正常对照组中放大后的蛋白质峰m / z = 3255的质谱峰图；
[0033]图4为本发明实施例中胃癌脾虚证组与正常对照组中放大后的蛋白质峰m/z = 5439的质谱峰图；
[0034]图5为本发明实施例中胃癌脾虚证组与正常对照组唾液无创分子诊断模型树状 图；
[0035]图6为本发明实施例中诊断模型十字交叉验证的ROC曲线。
【具体实施方式】
[0036]以下将配合附图及实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用 技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
[0037] 实施例
[0038] 1病例选择
[0039] 1.1诊断标准
[0040] 1.1.1胃癌诊断标准
[0041 ]胃癌的诊断根据《内科学》的诊断标准。
[0042] 1.1.2脾虚证诊断标准
[0043] (1)脾虚证:脾虚证包括脾虚与气虚两部分：
[0044] 气虚主症:①体倦乏力；②神疲懒言；③舌质淡、舌体胖或有齿痕，苔薄白；④脉细 弱。
[0045] 脾虚主症:①胃纳减少或食欲差;②大便不正常(溏、烂、先硬后溏、时溏时硬）；③ 食后腹胀，午后腹胀。
[0046] 脾虚次症：口淡不渴，喜热饮，口泛清涎，腹痛绵绵或喜按喜温，或得食则减，或遇 劳则发，恶心呕吐，脘闷肠鸣，消瘦或虚胖，面色萎黄，唇淡，短气，浮肿，久嗽，痰多清稀，失 眠不寐，排便无力，白带清稀，小便清长。
[0047] 气虚主症2个+脾虚主症2个，或气虚主症舌象+脾虚主症2个，或气虚主症舌象+脾 虚1个加次症2个，即可诊断为脾虚证。
[0048] (2)非脾虚证：胃癌患者不符合上述脾虚证的诊断，均为胃癌非脾虚证。
[0049] 1.2纳入标准
[0050] (1)符合诊断标准，未经手术和放化疗；
[0051 ] (2)年龄在20-75岁之间；
[0052] (3)自愿且能够配合参加的受试对象。
[0053]以上3项必须全部符合才能纳入。
[0054] 1.3排除标准
[0055] (1)不符合上述诊断标准者；
[0056] (2)年龄 <20 或 >75 岁者；
[0057] (3)患有口腔局部及唾液腺的炎症、消化道溃疡、肿瘤及先天性疾病；患有舍格伦 综合征、囊性纤维病;患有其他系统严重并发疾病。
[0058] h 4质量控制
[0059] (1)采用统一诊断标准、统一调查表格、统一调查方法；
[0060] (2)调查者在调查时严格按照"标准化"执行，减少调查者偏倚，确保资料的一致性 和真实性；
[0061] (3)电子胃镜及病理结果均由1月内三级甲等医院诊断。
[0062] 2纳入病例基本资料
[0063]本研究共纳入2014年12月-2015年04月在湖南省肿瘤医院胃十二指肠胰腺外科胃 癌脾虚证患者40例，男25例、女15例；胃癌非脾虚证患者17例，均为术前未进行放化疗，男14 例、女3例;年龄36-68岁，中位年龄52岁；正常对照组45例，男28例、女17例;年龄23-72岁，中 位年龄52岁，均来自于湖南中医药大学附属第一医院体检科健康自愿者。所有病例均按照 纳入标准进行纳入。
[0064] 3研究分组
[0065] 40例未进行任何治疗的胃癌脾虚证患者为胃癌脾虚证组(A组），17例未进行任何 治疗的胃癌脾虚证患者为胃癌非脾虚证组(B组），45例健康志愿者为正常对照组(N组）。 [0066] 4实验方法
[0067] 4.1主要仪器和试剂
[0068] 蛋白指纹图谱（液体芯片）试剂盒(WCX磁珠、Wash Buffer、Elution Buffer、U9裂 解液)及MALDI-TIF-MS(蛋白指纹图谱仪I型），均为湖州赛尔迪生物医药科技有限公司产 品，试剂盒批号为K20150501; dH20(HPLC级）、CHCA为Sigma公司产品。
[0069] 4.2样品收集
[0070]按照本课题专用临床观察表进行临床观察记录。取材前一天晚上临睡前清水漱口 三次(不再进任何食物和药物），采用非刺激性唾液采集方式，第二天晨起后漱口前空腹取 材。由经过培训的课题组专人取材，前5min内的唾液自然吞下后开始收集，患者将已经过消 毒的无菌小圆柱形棉花含入口中，口腔唾液积聚至一定量后，将该棉花吐入置于冰浴中的 15ml唾液离心管内，4°C下静置Ih后，3000r/min、4°C下离心10min，冰浴上分装在Iml的EP管 中，每管200μ1，于-80°C冰箱冷冻保存。实验时取出样本，冰上解冻，所有检测唾液样本均1 次冻融。取5μ1唾液加入10μ1的U9裂解液，混合孵育30min后，加入185μ1的Wash Buffer稀释 (唾液最终上样量为2· 5μ1)。
[0071] 4.3纳米磁珠预处理
[0072] ①取WCX纳米磁珠50μ1加入到200μ1的PCR管，置于磁铁上孵育lmin(注意避免由于 孵育时间过长导致磁珠结块），去除上清液;②再依次加入IOOyl的Wash Buffer洗脱5min， 在磁铁上孵育Imin，去除上清液;再重复步骤②操作一次。
[0073] 4.4唾液样品洗脱上样
[0074]①向每个装有纳米磁珠的PCR管中加入100μΙ处理好的唾液样品，混匀后，置于室 温孵育30min，将PCR管置于磁铁上孵育Imin，去除上清液;②每管加入100μΙ的Wash Buffer 洗脱5min，然后将PCR管置于磁铁上孵育lmin，去除上清液;再重复步骤②操作一次。③在 PCR管中加入10μ1的Elution Buffer洗脱5min(不能少于5min)，将PCR管置于磁铁上孵育 lmin，取5μ1上清液移至另一个PCR管中；④装有5μ1上清液的PCR管中加入5μ1的CHCA(基质） 饱和溶液，充分混匀（混合到样品颜色发灰，而没有明显的沉淀并及时上样），取2μ1混合溶 液(ΙμL唾液样品+ΙμL基质）加样到Au/Steel芯片上，待干后放入仪器读取。
[0075] 4.5芯片检测、数据采集和参数设置
[0076] 采用蛋白指纹图谱仪I型(湖州赛尔迪生物医药科技有限公司）质谱仪读取芯片信 息。设置激光强度为190，灵敏度为5，收集数据的质荷比(m/z)范围为2000~25000m/z，优化 范围为2000~15000m/z，信号收集位置40~60,平均每点收集20次，收集总点为100次。已知 多肽标准芯片标准（all-in-one)，激光离子流0 · 5。用Ciphergen Proteinchip Software 3.2.1软件自动采集数据，纵坐标为峰强度(蛋白相对含量），横坐标为蛋白质质荷比(m/z)。
[0077] 4.6数据分析
[0078] 对位于2000~25000m/z峰值，用Biomarker Wizard软件过滤噪音。设置初始的噪 音过滤值为5,二次信噪比为2,以10%为最小阈值进行聚类，经上述数据预处理后，采用t检 验比较2组唾液蛋白质质谱数据（由Biomarker Wizard软件完成），找出2组之间具有统计学 意义的差异表达蛋白质峰。用Biomarker Pattern Software 5.0.2采用决策树算法计算出 多个变量(m/z蛋白质质谱峰)变化对两样本的判别价值(诊断贡献度），确定最优化的诊断 模型。
[0079] 5 结果
[0080] 5.1胃癌脾虚证组与正常对照组对比
[0081 ] 两组共85份唾液标本，经过标准化后，在相对分子质量为2000~25000Da范围内共 检测到375个蛋白质峰，两组间比较，符合m/z强度平均值的比值>2(脾虚证/正常对照组> 2,或者正常对照组/脾虚证>2)的条件，共有106个差异蛋白质峰有统计学意义(P<0.05)， 其中有101个蛋白峰差异具有非常显著性意义（P<0.01)(胃癌脾虚证与正常对照组之间 ratio>4差异有统计学意义的蛋白质峰，见表1)，（胃癌脾虚证及正常对照组典型图谱，图 1)。其中，26个质峰在脾虚证组表达下调，80个质峰在脾虚证组表达上调。
[0082]表1胃癌与正常对照组之间差异有统计学意义的蛋白质峰(ratio>4)

[0085]图1为胃癌脾虚证组与正常对照组典型图谱，上第1、2幅图为胃癌脾虚证组，下第 3、4幅图为正常对照组。胃癌脾虚证组质峰范围主要在1000-4500Da，正常对照组质峰范围 主要在1000-5000Da。纵坐标为峰强度(蛋白相对含量），横坐标为蛋白质质荷比(m/z)。 [0086] 图3为胃癌与正常对照组MALDI质谱峰图(m/z = 3255 )，纵坐标为峰强度(蛋白相对 含量），横坐标为蛋白质质荷比(m/z)。上第1、2幅图为胃癌脾虚证组，下第3、4幅图为正常对 照组。与正常对照组对比，胃癌脾虚证组表达下调。
[0087] 5.2胃癌脾虚证组与胃癌非脾虚证组对比
[0088] 两组共57份唾液标本，经过标准化后，在相对分子质量为2000~25000m/z范围内 共检测到375个蛋白质峰，质峰多集中在0~15000m/z之间（胃癌脾虚证及胃癌非脾虚证典 型图谱，图2)。满足P<0.05,且两组m/z强度平均值得比值>2(脾虚证/非脾虚证>2,或者 非脾虚证/脾虚证>2)的条件，两组间比较，共有6个差异蛋白质峰（3225.359、2493.291、 5380.163、5306.461、5355.632、5439.673)有统计学意义（Ρ<0· 05)，共有2个蛋白峰 (5380.163、5439.673)(图3、图4)差异具有非常显著性意义（Ρ<0.01)(表2)。其中， 3225.359、2493.291两个质谱峰在脾虚证组表达下调，而5380.163、5306.461、5355.632、 5439.673在脾虚证组表达上调。
[0089]表2癌脾虚证组与胃癌非脾虚证组之间差异有统计学意义的蛋白质峰(ratio>2)
[0091]图2为胃癌脾虚证组与胃癌非脾虚证组典型图谱，上第1、2幅图为胃癌脾虚证组， 下第3、4幅图为正常对照组。胃癌脾虚证组质峰范围主要在0-40000Da，正常对照组质峰范 围主要在0_30000Da。纵坐标为峰强度(蛋白相对含量），横坐标为蛋白质质荷比(m/z)。 [0092] 图4为胃癌与正常对照组MALDI质谱峰图（m/z = 5439)上第1、2幅图为胃癌脾虚证 组，下第3、4幅图为正常对照组。与正常对照组对比，胃癌脾虚证组表达上调。纵坐标为峰强 度(蛋白相对含量），横坐标为蛋白质质荷比(m/z)。
[0093] 5.3胃癌脾虚证分子诊断模型建立
[0094] 用Biomarker Pattern Software 5.0.2米用决策树算法计算出多个变量(m/z蛋 白质质谱峰)变化对两组样本的判别价值(诊断贡献度），最终选定m/z为5439.67、2411.67、 3619.18建立胃癌脾虚证唾液无创分子诊断模型（图5)，经临床回代检验，该模型的灵敏度 和特异度分别为100 % (40/40)和93 % (42/45)(见表3)。
[0095] 弄3所律诠断樽型对g癌胞虑证的诠断效銮0你床冋代拾3合结里）
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[0098] 5.4诊断模型十字交叉验证
[0099]对所建立的胃癌脾虚证诊断模型采用十字交叉法进行验证，结果该模型的灵敏度 和特异度分别87 % (35/40)和89 % (40/45)(表4)。
[0100]表4所建诊断模型对胃癌脾虚证的诊断效率(十字交叉验证结果）
[0102] 图6为诊断模型十字交叉验证的ROC曲线，轴坐标为假阳性率（1-特异度），纵坐标 为真阳性率（灵敏度KROC曲线下面积越大，其诊断价值越高。图6中ROC曲线下面积为 0.976，进一步地验证所建立模型的诊断价值。
[0103] 病证结合已经成为现代中西医结合临床的主要模式。鉴于不同疾病的特征性病理 实质不同，开展病证结合的证候诊断客观化研究是十分必要的。脾虚是中医临床最常见的 基本证候之一，也是胃癌的重要病机和常见证候。本发明运用WCX与MALDI-T0F-MS蛋白质组 学技术，基于唾液蛋白质组开展胃癌脾虚证病证结合分子诊断研究，发现胃癌脾虚证与非 脾虚证比较，有6个差异蛋白峰具有统计学意义(P<0.05)，其中有2个差异蛋白峰(m/z分 别为5439·67、5380.16)具有非常显著意义（Ρ<0·01)。经Biomarker Patterns 5.0.2诊断 模型软件筛选出m/z为5439.67、2411.67、3619.18等3个差异蛋白质峰建立胃癌脾虚证与正 常对照组的诊断判别模型。经临床回代检验，该模型的灵敏度和特异度分别达100% (40/ 40)和93% (42/45);通过交叉验证法进一步验证诊断模型的可靠性，结果该模型的灵敏度 和特异度分别为87% (35/40)和89% (40/45)。说明该模型对胃癌脾虚证的诊断效率优良， 灵敏度高、特异性强。
[0104] 如在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定成分或方法。本领域技术 人员应可理解，不同地区可能会用不同名词来称呼同一个成分。本说明书及权利要求并不 以名称的差异来作为区分成分的方式。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的"包含"为 一开放式用语，故应解释成"包含但不限定于"。"大致"是指在可接收的误差范围内，本领域 技术人员能够在一定误差范围内解决所述技术问题，基本达到所述技术效果。说明书后续 描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明本发明的一般原则为目的，并非 用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
[0105] 还需要说明的是，术语"包括"、"包含"或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的 包含，从而使得包括一系列要素的商品或者系统不仅包括那些要素，而且还包括没有明确 列出的其他要素，或者是还包括为这种商品或者系统所固有的要素。在没有更多限制的情 况下，由语句"包括一个……"限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系统中还 存在另外的相同要素。
[0106] 上述说明示出并描述了本发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本发明 并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、 修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识 进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发 明所附权利要求的保护范围内。
【主权项】
1. 一种胃癌脾虚证唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法，其特征在于，包括W下 步骤： (1) 样品收集； (2) 纳米磁珠预处理； (3) 样品预处理:取出冷冻保存的唾液样品，冰上解冻，所有唾液样品均1次冻融，取扣1 所述唾液品加入1〇μ1的U9裂解液，混合解育30min后，加入18化1的Wash Buffer稀释； (4) 唾液样品洗脱上样:③向每个装有纳米磁珠的PCR管中分别加入10化1预处理后的 所述唾液样品，混匀，置于室溫解育30min，将所述PCR管置于磁铁上解育Imin，去除上清液； ④每管加入10化1的Wash Buffer洗脱5min，然后将所述PCR管置于磁铁上解育Imin，去除上 清液;再重复步骤④操作一次;⑤在所述PCR管中加入10μ1的Elution Buffer洗脱5min，将 所述PCR管置于磁铁上解育Imin，取扣1上清液移至另一个PCR管中；⑥将装有扣1上清液的 PCR管中加入化1的C肥A饱和溶液，充分混匀，至样品颜色发灰，而没有明显的沉淀时，取化1 混合溶液，加样到Au/Steel忍片上，惊干后放入仪器读取； (5) 质谱分析:采用质谱仪读取所述Au/Steel忍片信息，设置激光强度为190,灵敏度为 5; (6) 数据采集； (7) 数据分析； (8) 建立诊断模型：用Biomarker Pattern Software 5.0.2采用决策树算法计算出多 个变量变化对两样本的判别价值，确定最佳的诊断模型。2. 如权利要求1所述的胃癌脾虚证唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法，其特征 在于，所述步骤（1)样品收集的方法为：胃癌脾虚证组和正常对照组在取材前一天晚上临睡 前清水漱口，之后不再进食任何食物和药物，于第二天晨起后漱口前采用非刺激性唾液采 集方式空腹取材，前5min内的唾液自然吞下后开始收集，收集到的唾液置于冰浴中的15ml 唾液离屯、管内，4°C下静置化后，300化/min、4°C下离屯、lOmin，冰浴上分装在1ml的EP管中， 每管20化1，于-80°C冰箱冷冻保存备用。3. 如权利要求2所述的胃癌脾虚证唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法，其特征 在于，所述步骤(2)纳米磁珠预处理的方法为:①取WCX纳米磁珠50μ1加入到20化1的PCR管 中，置于磁铁上解育Imin，去除上清液;②再加入10化1的Wash Buffer洗脱5min，在磁铁上 解育Imin，去除上清液;再重复步骤②操作一次。4. 如权利要求3所述的胃癌脾虚证唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法，其特征 在于，所述步骤(6)数据采集的方法为：用〔;[曲日巧日]1?1'〇1日;[]1证19 5〇的￥日'日3.2.1软件采 集数据，纵坐标为峰强度，横坐标为蛋白质质荷比，收集数据的质荷比范围为2000~ 25000m/z，信号收集位置40~60,平均每点收集20次，收集总点为100次，已知多肤标准忍片 标准，激光离子流0.5。5. 如权利要求4所述的胃癌脾虚证唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法，其特征在 于，所述步骤(7)数据分析的方法为:对位于2000~25000m/z峰值，用Biomarker Wizard软件 过滤噪音;设置初始的噪音过滤值为5,二次信噪比为2, WlO%为最小阔值进行聚类，经上 述数据预处理后，采用t检验比较所述胃癌脾虚证组和所述正常对照组唾液蛋白质质谱数 据，找出所述胃癌脾虚证组和所述正常对照组之间具有统计学意义的差异表达蛋白质峰。6. 如权利要求5所述的胃癌脾虚证唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法，其特征 在于，步骤(7)中，设置P<0.01，所述胃癌脾虚证组和所述正常对照组之间具有统计学意义 的差异表达蛋白质峰有101个，其中所述胃癌脾虚证与所述正常对照组比值比率>4的有17 个差异蛋白，其中，有4个蛋白质峰在所述胃癌脾虚证组表达下调，13个蛋白质峰在所述胃 癌脾虚证组表达上调，所述17个差异蛋白具体如下：7. 如权利要求6所述的胃癌脾虚证唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法，其特征 在于，步骤(6)所述荷质比范围为2000~15000m/z。
【文档编号】G01N27/62GK105842327SQ201610168131
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年3月23日
【发明人】吴正治, 谢梦洲, 黄飞娟, 曹美群, 孙珂焕, 贺佐梅
【申请人】深圳市老年医学研究所, 吴正治