黄花列当指纹图谱建立方法以及质量评价方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及药物分析领域，具体涉及中药材指纹图谱建立方法和药材质量评价方 法。
【背景技术】
[0002] 黄花列当，又名独根草。为列当科列当属植物黄花列当（Orobanche pycnostachya Hance)的干燥全草。分布于东北、华北、山西、陕西等地。具有补肾助阳，强筋骨的功效，用于 治疗肾虚腰膝冷痛、阳痿遗精、神经官能症，小儿腹泻等症。民间也作为名贵药材"沙漠人 参"肉从蓉的代用品。列当科植物普遍含有苯乙醇苷，是苯乙醇苷类成分的重要资源植物。 现代药理研究表明该类化合物具有良好医疗价值，如:抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、 清除自由基、免疫调节、增强记忆、保肝、强心等作用。
[0003] 中药指纹图谱是目前国内外公认的能较全面的反映药材信息，鉴别药材品种和评 价中药质量的有效手段之一，它主要是通过采用现代色谱及波普技术得到中药组分群体共 有特征的图谱或图像。
[0004] 目前关于对列当药材的质量控制未见较全面的报道，《中国药典》中也未对其质量 标准进行收载。因此，建立能较全面反映列当药材质量信息的方法，对于指导列当药材入 药，加大列当药材开发利用限度是非常有必要和有意义。
【发明内容】
[0005] 本发明提出一种黄花列当指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：
[0006] 1)供试品溶液的制备:取黄花列当药材粉末，加70 %甲醇，称定重量，浸泡，超声处 理，用溶剂补足减失的重量，滤过，取续滤液以〇. 45μπι微孔滤膜滤过，备用；
[0007] 2)将供试品溶液注入高效液相色谱仪中，获得指纹图谱，采用的色谱条件为:色谱 柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱;流动相：乙腈(Α)_1%〇磷酸水溶液(Β)，梯度洗脱89 %Β (Omin)~85%B(13min)~81 %B(22min)~78%B(33min)~76%B(50)min;流速：lml/min; 检测波长230~400nm;柱温20~30°C;进样量5~15μ1〇
[0008] 作为优选，色谱柱采用规格为250mmX4.6mm，5ym的岛津Inertsil ODS-SP HPLC色 谱柱或者YMC-Pack 0DS-A色谱柱。
[0009] 进一步的优选是，步骤1)中，取黄花列当药材粉末0.15g，加70%甲醇25ml，称定重 量，浸泡lh，超声处理40min，用溶剂补足减失的重量，滤过，取续滤液以0.45μπι微孔滤膜滤 过。
[0010] 更优选地，流速为lml/min;检测波长295nm;柱温25°C;进样量10μ1。
[0011]本发明还提供一种利用指纹图谱评价黄花列当药材质量的方法，包括以下步骤： 步骤一:建立标准指纹图谱，包括:a)分别从10批以上不同产地的样品制备供试品溶液:取 黄花列当药材粉末，加70 %甲醇，称定重量，浸泡，超声处理，用溶剂补足减失的重量，滤过， 取续滤液以〇 . 45μπι微孔滤膜滤过，备用；b)对照品溶液的制备：称取1)α-L-鼠李糖（1-3)
[β-D-葡萄糖（l-6)]-0-(4-0-咖啡酰)-D-葡萄糖咖啡酰三糖苷、2)芥子酸-4-0-?Η)葡萄糖 苷、3) 7-羟基毛蕊花糖苷、4) 7-甲氧基毛蕊花糖苷、5)毛蕊花糖苷、6)圆齿列当苷、7)3'-甲 氧基毛蕊花糖苷）、8)2'_乙酰毛蕊花糖苷、9)异圆齿列当苷共9种对照品，用甲醇溶解定容， 制成一定浓度的混合溶液，微孔滤膜〇. 45μπι滤过，备用;c)先后将各供试品溶液和对照品溶 液注入高效液相色谱仪中，分别获得指纹图谱，色谱条件为:色谱柱:十八烷基硅烷键合硅 胶色谱柱;流动相：乙腈(Α)-1%。磷酸水溶液(Β)，梯度洗脱89%B(0min)~85%B(13min)~ 81%B(22min)~78%B(33min)~76%B(50)min;流速：lml/min;检测波长 230 ~400nm;柱温 20~30°C;进样量5~15μ1;(1)用相似度评价软件评价17个样品的指纹图谱，从中确定一个 标准指纹图谱。步骤二：用上述相同的方式获得一个待评价样品的指纹图谱;步骤三：用前 述相似度评价软件评价所述待评价样品指纹图谱和所述标准指纹图谱的相似度，相似度大 于0.9则判定所述待评价样品质量符合要求。
[0012] 进一步地，所述标准指纹图谱包含以下15个特征峰，其中10号峰为参照峰，其相对 保留时间和相对峰面积为1.00，各峰的相对保留时间分别为：8.07、12.22、20.11、20.74、 25·17、26·56、27·00、28·32、32·58、35·76、38·46、40·35、41·06。
[0013] 更进一步地，所述标准指纹图谱的15个特征峰的相对峰面积分别为0.0035、 0·0053、0·0038、0·0099、0·0114、0·0086、0·0073、0·0041、0·0042、1·000、0·1995、0·0263、 0·0546、0·0086、0·003711·。
[0014] 更进一步地，用所述标准指纹图谱中所述9个对照品对应的峰的参数，与待测样品 对应的峰参数进行相似度评价，相似度大于0.90时判定药材复合要求。
[0015] 根据本发明的供试品溶液制作方法操作溶液，具有较高的精密度、稳定性、和重现 性，系统适用性强，可适用于用于该属药材的制作。所建立的黄花列当指纹图谱分析方法灵 敏度高，重现性好;所获得的标准指纹图谱具有典型性、代表性，能较全面的反映黄花列当 药材中所含的化学成分种类与数量，进而对药材的整体评价和描述提供一个更为全面的依 据。本发明建立的黄花列当药材高效液相指纹图谱技术，弥补了现今尚属空白的列当药材 质量控制的方法，使列当药材的质量控制技术更加全面。
【附图说明】
[0016] 图1是根据本发明的方法获得的对照品指认图谱。
[0017] 图2是根据本发明的方法获得的标准指纹图谱。
[0018] 图3是17批黄花列当药材HPLC指纹图谱叠加图。
【具体实施方式】 _9] 供试品溶液的制备
[0020]该环节中，取黄花列当药材粉末，加入计算量的甲醇溶液，浸泡后进行超声处理， 用溶剂补足减失的重量，滤过，取续滤液，以〇. 45μπι微孔滤膜滤过，备用。
[0021 ]本发明中，使用甲醇水溶液作为供试品溶剂，甲醇溶液的浓度范围可以在50-90% 之间，优选在60-80 %之间，最优选70 %的甲醇溶液。
[0022]本发明中，优选将黄化列当粉粹成40目以下，使用时过40目筛，提取方法可以是回 流或者超声处理，优选在处理之前浸泡若干时间，优选浸泡1小时。优选通过超声提取，提取 时间可以是20_80min，优选提取40min。
[0023] 本发明中，取样的量可以在0.1-0.3g的范围，在采用上述最优选方式的情况下，优 选取样0.15g，加70 %甲醇25ml，称定重量，浸泡lh，超声处理40min，放置到室温后，再称定 重量，用溶剂补足减失的重量，滤过，取续滤液以〇.45μπι微孔滤膜滤过，得到供试品溶液。
[0024] 因此，在本发明的最优选的黄花列当供试品溶液的制备方法为：取药材粉末约 0.15g，精密称定，置100mL具塞锥形瓶中，精密加入70 %甲醇25mL，浸泡lh，超声提取40min， 放置到室温后，再称定重量，用溶剂补足减失的重量，滤过，取滤液以0.45μπι微孔滤膜滤过， 即得。
[0025] 对照品溶液的制备
[0026]取各对照品适量，分别编号，用甲醇溶解定容，制成一定浓度的溶液，微孔滤膜 (0.45μπι)滤过，备用。所使用的对照品共有以下9个：
[0027] a-L-鼠李糖葡萄糖^46)=-0-(4-0-咖啡酰)-D-葡萄糖
[0028] 芥子酸-4-〇-0_D 葡萄糖苷（Sinapoyl_4-〇-0-D-glucopyranoside)
[0029] 7_羟基毛蕊花糖苷（campneosideΠ )
[0030] 7_甲氧基毛蕊花糖苷(campneosidel，又称圆齿列当苷）
[0031 ] 3'-甲氧基毛蕊花糖苷（leucosceptosideA)
[0032] 2'-乙酰毛蕊花糖苷（2'-306七}43(^6081(16)
[0033] 异圆齿列当昔（isocrenatoside)
[0034] 色谱条件
[0035] 本发明中使用的色谱条件优选为:色谱柱是十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱;流动 相是乙腈（Α)-1%。磷酸水溶液（B)，采用梯度洗脱89%B(0min)~85%B(13min)~81%B (22min)~78%B(33min)~76%B(50)min;检测波长230 ~400nm;柱温 20 ~30°C;进样量 5 ~ 15μ1〇
[0036] 在本发明的最佳实施例中，确定黄花列当HPLC指纹图谱分析的最优色谱条件为： 色谱柱：岛津Inertsil 0DS-SP HPLC色谱柱或者YMC-Pack 0DS-A色谱柱（250mmX4.6mm，5y m);流动相：乙腈-〇.1%磷酸水溶液，梯度洗脱：89%8(〇111丨11)~85%8(131^11)~81%8 (22min)~78%B(33min)~76%B(50)min;流速：1.0ml/min;检测波长 295nm;柱温 25°C;进 样量10μ1。
[0037] 标准指纹图谱的建立
[0038] 采用上述色谱条件，，测定17批次不同产地、不同采集时间的黄花列当样品，获得 17份指纹图谱，确定15个共有峰，并以前述9个化合物作为对照指认其中9个，用相似度评价 软件评价17个样品的指纹图谱，从中选择一个相似度最大的指纹图谱一一S9号药材指纹图 谱作为标准指纹图谱。对照品指认图谱（由前述对照品获得)与S9号药材图谱的比较如图1 与图2。
[0039] 采用前述最优选的各项参数和色谱条件，该标准指纹图谱包含15个共有峰，其保 留时间和相对峰面积见表1。
[0040] 表1黄花列当标准指纹图中共有峰的相对保留时间和相对峰面积
[0043]该标准指纹图谱中，结构确定的9个峰与标准指纹图谱中的