峰号对应如下： [0044] 2号:-L-鼠李糖（1-3) [ β-D-葡萄糖（1-6) ] -0- (4-0-咖啡酰)-D-葡萄糖
[0045] 4号：芥子酸-4_〇-β-〇 葡萄糖苷（Sinapoyl-4-〇-3_D-glucopyranoside)
[0046] 6号：7_羟基毛蕊花糖苷（campneosidell)
[0047] 7号:7_甲氧基毛蕊花糖苷(campneosidel)
[0048] 10号：毛蕊花糖苷
[0049] 11号：圆齿列当昔（crenatoside)
[0050] 12号：3' 甲氧基毛蕊花糖苷（leucosceptosideA)
[0051 ] 13号：2_ 乙酰毛蕊花糖苷（2'_acetylacteoside)
[0052] 14号：异圆齿列当昔（isocrenatoside)
[0053] 在本发明的实施例中，从如下来源的17个黄花列当样品中建立标准指纹图谱。
[0054] 表2. 17批黄花列当药材信息
[0057] 黄花列当药材质量评价
[0058]根据本发明，可以利用上述指纹图谱建立的条件获得待评价样品的指纹图谱，然 后将其与前述标准指纹图谱进行比较，利用相似度评价软件进行评价，考察其相似性，相似 度为0.90-1.00则判定样品符合要求。本发明的典型实施例中采用的评价软件是国家药典 委员会推荐的中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版）。在另一种实施方式中，仅仅将 前述对照品峰参数与待评价样品的对应的峰参数进行相似性评价。相似度大于0.90的则判 定产品符合要求。在另一种实施方式中，可以将前两个方式相结合，当两次得到的相似度皆 大于ο. 90时，分析结果更可靠和精准。
[0059] 方法学验证
[0060] 精密度的考察
[0061] 按照前述最优选的供试品溶液制备方法制备样品，按照前述最优选指纹图谱色谱 条件，连续进样分析6次。将所得数据输入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，计算得到精 密度匹配数据和精密度匹配的相似度数据，同时计算共有峰的相对保留时间及相对峰面积 的比值。结果黄花列当供试品溶液通过HPLC分析后各共有峰的相对保留时间和相对峰面积 比值的RSD值分别在0.01 %~0.08 %和0.75 %~3.87 %之间，表明整个仪器检测系统的精 密度良好。结果见表3和表4所示。
[0062] 表3.黄花列当精密度匹配数据及相对保留时间、相对峰面积的RSD值
[0063]
[0064] 表4.精密度匹配的相似度数据
[0067] 重复性考察
[0068] 按照前述最优选的供试品溶液制备方法平行制备S11号样品6份，按照前述最优选 指纹图谱色谱条件，连续进样分析。将所得数据输入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，计 算得到重复性匹配数据和重复性匹配的相似度数据。同时计算共有峰的相对保留时间和相 对峰面积的比值。结果见表5、6。结果显示，6份黄花列当供试品溶液通过HPLC分析，RSD值分 别在0.01 %~0.14%和0.87 %~4.40 %之间，表明该方法的重复性良好。
[0069] 表5.重复性匹配数据及相对保留时间、相对峰面积的RSD值
[0070]
[0071] 表6.重复性匹配的相似度数据
[0072]
[0073] 稳定性考察
[0074]取同一份供试品溶液分别在0、2、4、8、121!进样1(^1^分析。将所得数据输入中药色 谱指纹图谱相似度评价系统，计算得到稳定性匹配的相似度数据和稳定性匹配数据。同时 计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积的比值。结果见表7、8。结果在12h内相对保留时 间及相对峰面积比值的RSD值在分别在0.01 %~0.10%和1.16%~4.77 %之间，表明供试 品溶液在12h内稳定性良好。
[0075]表7.黄花列当稳定性匹配数据及相对保留时间、相对峰面积的RSD值
[0078]表8稳定性匹配的相似度数据
[0080] 以上方法学考察表明：目前建立的指纹图谱操作方法可行，可用于黄花列当指纹 图谱的建立和分析。
[0081] 17批黄花列当样品相似度评价
[0082] 前述17批黄花列当药材中各取一份样品，用前述相同的方法得到各批药材的HPLC 指纹图谱，利用"中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版)"对各色谱图中的15个共有 峰进行分析评价，以平均数法计算相似度，得出17批药材的相似度及相似度匹配数据(表9、 10)。各批次样品HPLC指纹图谱叠加图见图3。
【主权项】
1. 一种黄花列当指纹图谱的建立方法，包括以下步骤： 1) 供试品溶液的制备：取黄花列当药材粉末，加70%甲醇，称定重量，浸泡，超声处理， 用溶剂补足减失的重量，滤过，取续滤液以〇. 45μπι微孔滤膜滤过，备用； 2) 将供试品溶液注入高效液相色谱仪中，获得指纹图谱，采用如下色谱条件： 色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱； 流动相：乙腈(Α)-1%。磷酸水溶液(Β)，梯度洗脱89%B(0min)~85%B(13min)~81%Β (22111；[11)~78%13(33111；[11)~76%13(50)111；[11;流速：11111/111；[11; 检测波长230~400nm;柱温20~30°C;进样量5~15μ1。2. 权利要求1所述的处理方法，其中，色谱柱采用规格为250mm X 4.6mm，5μπι的岛津 Inertsil ODS-SP HPLC色谱柱或者YMC-Pack ODS-A色谱柱。3. 权利要求1所述的处理方法，其中，步骤1)中，取黄花列当药材粉末0.15g，加70%甲 醇25ml，称定重量，浸泡lh，超声处理40min，用溶剂补足减失的重量，滤过，取续滤液以0.45 μπι微孔滤膜滤过，备用。4. 权利要求3所述的处理方法，其中，流速为lml/min;检测波长295nm;柱温25°C ;进样 量 10μ1〇5. -种利用指纹图谱评价黄花列当药材质量的方法，包括以下步骤： 建立标准指纹图谱，包括:a)分别从10批以上不同产地的样品制备供试品溶液:取黄花 列当药材粉末，加70 %甲醇，称定重量，浸泡，超声处理，用溶剂补足减失的重量，滤过，取续 滤液以0.45μπι微孔滤膜滤过，备用;b)对照品溶液的制备:称取1) α-L-鼠李糖（1-3) [ β-D-葡萄糖（1-6)]-0-(4-0_咖啡酰)-D-葡萄糖咖啡酰三糖苷、2)芥子酸-4-0-?Η)葡萄糖苷、3) 7-羟基毛蕊花糖苷、4)7-甲氧基毛蕊花糖苷、5)毛蕊花糖苷、6)圆齿列当苷、7)3'-甲氧基毛 蕊花糖苷）、8)2'_乙酰毛蕊花糖苷、9)异圆齿列当苷共9种对照品，用甲醇溶解定容，制成一 定浓度的混合溶液，微孔滤膜〇.45μπι滤过，备用;c)先后将各供试品溶液和对照品溶液注入 高效液相色谱仪中，分别获得指纹图谱，色谱条件为:色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶色谱 柱;流动相：乙腈(A)-1 %。磷酸水溶液(Β)，梯度洗脱89 %B(Omin)~85 %Β(13min)~81 %Β (22min)~78%B(33min)~76%B(50)min;流速：lml/min;检测波长230 ~400nm;柱温 20 ~ 30°C;进样量5~15μ1;(1)用相似度评价软件评价17个样品的指纹图谱，从中确定一个标准 指纹图谱。 用上述相同的方式获得一个待评价样品的指纹图谱； 用前述相似度评价软件评价所述待评价样品指纹图谱和所述标准指纹图谱的相似度， 相似度大于〇. 9则判定所述待评价样品质量符合要求。6. 权利要求5所述的处理方法，其中，色谱柱采用规格为250mm X 4.6mm, 5μηι的岛津 Inertsil ODS-SP HPLC色谱柱或者YMC-Pack ODS-A色谱柱。7. 权利要求5所述的处理方法，其中，步骤1)中，取黄花列当药材粉末0.15g，加70%甲 醇25ml，称定重量，浸泡lh，超声处理40min，用溶剂补足减失的重量，滤过，取续滤液以0.45 μπι微孔滤膜滤过，备用。8. 权利要求7所述的处理方法，其中，流速为lml/min;检测波长295nm;柱温25°C ;进样 量 10μ1〇9. 权利要求8所述的方法，其中，所述标准指纹图谱包含以下15个特征峰，其中10号峰 为参照峰，其相对保留时间和相对峰面积为1.00,各峰的相对保留时间分别为：8.07、 12.22、20.11、20.74、25.17、26.56、27.00、28.32、32.58、35.76、38.46、40.35、41.06。10.权利要求9所述的方法，其中，所述标准指纹图谱的15个特征峰的相对峰面积分别 为0·0035、0·0053、0·0038、0·0099、0·0114、0·0086、0·0073、0·0041、0·0042、1·000、 0·1995、0·0263、0·0546、0·0086、0·003711。
【专利摘要】本发明涉及黄花列当指纹图谱的建立方法，包括：1)供试品溶液的制备：取黄花列当药材粉末，加70％甲醇，称定重量，浸泡，超声处理，用溶剂补足减失的重量，滤过，取续滤液以0.45μm微孔滤膜滤过；2)将供试品溶液注入高效液相色谱仪中，获得指纹图谱，其中，色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；流动相：乙腈(A)-1‰磷酸水溶液(B)，梯度洗脱89％B(0min)～85％B(13min)～81％B(22min)～78％B(33min)～76％B(50)min；流速：1ml/min；检测波长230～400nm；柱温20～30℃。本发明还提供一种利用指纹图谱评价黄花列当药材质量的方法。根据本发明所建立的黄花列当指纹图谱分析方法灵敏度高，重现性好；所获得的标准指纹图谱能较全面的反映黄花列当药材中所含的化学成分种类与数量。
【IPC分类】G01N30/02
【公开号】CN105572258
【申请号】CN201610030037
【发明人】王晓琴, 温爱平, 李彩峰, 杨来秀, 杨美珍, 杜月, 韩国庆, 黄慧
【申请人】内蒙古医科大学
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2016年1月15日