一种hplc法分离测定帕立骨化醇原料药及制剂中有关物质的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分析化学领域，具体涉及一种采用高效液相色谱法分离和测定帕立骨 化醇原料药及制剂中有关物质的方法。
【背景技术】
[0002] 帕立骨化醇为维生素 D活性物质骨化三醇的类似物，用于预防和治疗继发性甲状 旁腺功能亢进症（SHPT，主要表现为PTH升高），帕立骨化醇分子式为C 27H4403,化学名为（7E， 22E) -19-去甲基-9,10-开环麦角甾-5, 7, 22 -三烯-1 α，3 β，25-三醇，其结构式如下：
[0003]
[0004] 帕立骨化醇的注射制剂于1998年上市，目前已成为透析患者最广泛使用的SHPT 预防及治疗药物。帕立骨化醇的1、2和4mcg胶囊制剂也由FDA批准用于预防和治疗继发性 甲状旁腺功能亢进症，它对接受透析和移植手术前的III及IV期慢性肾脏疾病（CKD)患者的 SHPT显示出预防及治疗疗效，帕立骨化醇的胶囊制剂为口服制剂，通过口服途径给药，与注 射制剂相比使用更为便利，给药后可降低甲状旁腺激素（PTH)水平，同时对血钙及血磷水 平具有最小影响，PTH降低是SHPT治疗疗效的一个关键性指标。
[0005] USP37版帕立骨化醇原料药质量标准以及USP37版帕立骨化醇注射液质量标准均 采用反相高效液相色谱法来检测有关物质，本申请的发明人用这两种标准用于帕立骨化醇 胶囊制剂有关物质的检测均存在一定的局限性，原因在于：（1)帕立骨化醇软胶囊中油性 基质辅料峰较多，且辅料峰出峰范围在l〇min到30min之间，辅料峰较大，严重干扰本品有 关物质的检测；（2)由于产品规格很低，稀释进样后，不能满足杂质检出限水平；(3)采用反 相液相色谱法测定有关物质时，基质对主峰有一定的溶解能力，连续进样后，主峰保留时间 依次减少，在梯度洗脱中延长100%乙腈冲洗时间达30min，都不能完全抑制。因此，目前还 没有获得帕立骨化醇软胶囊的质量标准。
【发明内容】
[0006] 基于上述反相色谱法测定帕立骨化醇软胶囊的缺点，本申请的发明人建立了一种 正相液相色谱法，该方法采用梯度洗脱，提高了杂质检测的灵敏度，适用于帕立骨化醇软胶 囊及其原料药的质量控制。
[0007] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种HPLC法分离测定帕立骨化醇原料药及制 剂中有关物质的方法，该方法与现有的反向色谱法相比，能更准确、高效的测定帕立骨化醇 原料药及制剂中的有关物质。
[0008] 为实现上述目的，本发明的技术方案为：
[0009] -种HPLC法分离测定帕立骨化醇原料药及制剂中有关物质的方法，所述HPLC法 为正相HPLC法，所述正相HPLC法分析过程中采用的色谱柱固定相的极性大于流动相的极 性。
[0010] 进一步，所述HPLC法具体为：制备供试品溶液，采用高效液相色谱测定供试品溶 液中各物质的峰面积，按照峰面积归一化计算各物质的相对含量。
[0011] 在本发明的一个具体实施例中，所述的色谱柱采用的是硅胶填料的色谱柱，所述 硅胶填料粒径为3-5 μ m，优选5 μ m。色谱柱的长度为150mm-250mm，优选用250mm的色谱 柱。
[0012] 在本发明的一个具体实施例中，所述的流动相是采用流动相A和流动相B进行梯 度洗脱，所述的流动相A为正己烷，所述的流动相B为正己烷与具2-3个碳原子的醇的混合 物。
[0013] 进一步，所述流动相B中醇与正己烷的体积比为10-25 :75-90,优选为20:80。
[0014] 优选的所述醇为乙醇和/或异丙醇。
[0015] 进一步，所述醇为乙醇和异丙醇，优选的，所述异丙醇和乙醇的体积比为 40-60:60-40，更优选的，所述异丙醇和乙醇的体积比50:50。
[0016] 本发明中所述的方法，是采用梯度洗脱的方法，在一个具体实施例中，采用流动相 A和流动相B进行梯度洗脱，具体的洗脱条件为：
[0017] Omin，流动相A与流动相B的体积比为80:20 ;
[0018] 2min，流动相A与流动相B的体积比为80:20 ;
[0019] 30min，流动相A与流动相B的体积比为25:75 ;
[0020] 35min，流动相A与流动相B的体积比为25:75 ;
[0021] 35. Olmin，流动相A与流动相B的体积比为80:20 ;
[0022] 50min，流动相A与流动相B的体积比为80:20。
[0023] 本发明所述的方法，所述流动相的流速为0. 9-1. lml/min，优选1.0ml/min。
[0024] 本发明所述的方法，所述色谱柱柱温为40_50°C，优选为45°C，所述HPLC法分析过 程中采用的检测器为紫外检测器，DAD检测器和VWD检测器均适用，检测波长为252nm。
[0025] 本发明所述的方法，在帕立骨化醇原料药及其软胶囊的质量控制中的应用。
[0026] -种正相HPLC法分离测定帕立骨化醇软胶囊有关物质的方法，所述正相HPLC法 分析过程中采用的色谱柱是以硅胶为填料，以流动相A和流动相B进行梯度洗脱；所述的流 动相A为正己烷，所述的流动相B为正己烷与醇的混合物，所述醇为乙醇和/或异丙醇；所 述正相HPLC法分析过程包括制备帕立骨化醇软胶囊供试品溶液，采用高效液相色谱测定 供试品溶液中各物质的峰面积，按照峰面积归一化计算各物质的相对含量。
[0027] -种正相HPLC法分离测定帕立骨化醇原料药有关物质的方法，所述正相HPLC法 分析过程中采用的色谱柱是以硅胶为填料，以流动相A和流动相B进行梯度洗脱；所述的流 动相A为正己烷，所述的流动相B为正己烷与醇的混合物，所述醇为乙醇和/或异丙醇；所 述正相HPLC法分析过程包括制备帕立骨化醇原料药供试品溶液，采用高效液相色谱测定 供试品溶液中各物质的峰面积，按照峰面积归一化计算各物质的相对含量。
[0028] 本发明中有关物质含量计算方式如下：
[0029] 有关物质含量（％ ) = Α/ΑΦ100
[0030] 其中，Ai为测试样品中有关物质（杂质）的峰面积；
[0031 ] A为测试样品中所有峰面积的之和。
[0032] 帕立骨化醇软胶囊产品规格低，内容物可直接作为供试品溶液；帕立骨化醇原料 药供试品溶液的制备方法为：取一定量的帕立骨化醇原料药，先用无水乙醇溶解，制成贮备 液，使用时再用正己烷稀释成一定浓度作为帕立骨化醇原料药供试品溶液。
[0033] 本发明的有益效果在于：本发明的方法专属性强，帕立骨化醇与各杂质分离较好， 结果更准确、高效，克服了现有技术（反相色谱法）测定帕立骨化醇软胶囊有关物质的缺 点，可用于帕立骨化醇原料药及其软胶囊制备过程中杂质的检测和质量控制。
【附图说明】
[0034] 图1为系统适用性溶液的检测色谱图；
[0035] 图2为灵敏度溶液的检测色谱图；
[0036] 图3为采用本发明的方法检测帕立骨化醇软胶囊的色谱图；
[0037] 图4为采用本发明的方法检测帕立骨化醇软胶囊空白基质的色谱图；
[0038] 图5为采用本发明的方法检测帕立骨化醇原料药粗品的色谱图；
[0039] 图6为采用USP37版帕立骨化醇原料药质量标准检测帕立骨化醇软胶囊的色谱 图；
[0040] 图7采用USP37版帕立骨化醇原料药质量标准检测帕立骨化醇软胶囊空白基质得 到的色谱图；
[0041] 图8为采用USP37版帕立骨化醇原料药质量标准检测帕立骨化醇原料药粗品得到 的色谱图。
【具体实施方式】
[0042] 所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限 于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述
【发明内容】
对实施方案进行非本质的改 进和调整，仍属于本发明的保护范围。
[0043] 以下实施例中，采用的仪器及色谱柱如下：
[0044] 日本岛津SHIMADZU LC-2010AHT液相色谱仪，检测器：UV ;色谱工作站： LCsolution，色谱柱：silica 柱（250mmX 4. 6mm，5 μ m)，检测波长为 252nm，进样量为 50 μ 1 ; 流速：1. 0ml/min〇
[0045] 实施例1色谱条件的确定
[0046] 基于采用反相液相色谱法测定帕立骨化醇软胶囊有关物质的局限性，如本发明背 景中所述，经过反复筛选，最终选用正相色谱系统，并采取梯度洗脱的方式进行帕立骨化醇 软胶囊的有关物质检查，来提高检测灵敏度并减少大体积进样带来的峰宽扩展；提高柱温 到45°C来加快油性基质的出峰时间；选择用硅胶柱对本品杂质峰分离效果及主峰峰形均 较理想；同时为了提高对杂质的检测能力，将进样体积选择为1〇〇μ 1。专属性研究结果表 明，油性基质辅料峰在相对于主峰保留时间〇. 4以前出峰；主峰与原料药粗品中工艺杂质、 帕立骨化醇酸强制降解杂质、杂质A的分离良好，与USP36版帕立骨化醇注射液色谱系统相 当。确定的最佳色谱条件如下：
[0047] 流动相A为正己烧，流动相B为正己烷-异丙醇-乙醇，流动相B中正己烷、异丙 醇、乙醇的体积比为80:10:10(即正己烷与醇的体积比为80:20,所述醇为异丙醇和乙醇的 混合物，异丙醇与乙醇的体积比为50 :50)，流动相A与流动相B按下表1所列条件进行线 性梯度洗脱：
[0048] 表1线性梯度洗脱程序
[0049]
[0050] 以下实施例均以已确定的最佳色谱条件进行分析。
[0051] 实施例2
[0052] 杂质A为帕立骨化醇原料药合成过程中可能引入的杂质，其结构如下：
[0053]
[0054] 称取帕立骨化醇对照品约20mg，置10ml量瓶中，加无水乙醇使溶解并稀释至刻 度，作为帕立骨化醇对照品贮备液。
[0055] 称取杂质A对照品（含量95. 5 % )约10mg，置100ml量瓶中，加无水乙醇使溶解 并稀释至刻度，摇匀，作为杂质A对照品贮备液。
[0056] 分别量取帕立骨化醇对照品贮备液及杂质A对照品贮备液适量，加正己烷-异丙 醇（体积比90:10)稀释，制备成每lml中约含帕立骨化醇10. 0 μ g及杂质AO. lyg的