临床前药物代谢动力学关键技术与研究体系在培美曲塞的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及临床前药物代谢动力学关键技术与研究体系在培美曲塞的应用。
【背景技术】
[0002]在我国，癌症发病率接近世界水平，但死亡率高于世界水平。据相关资料估计，每年全国因肿瘤造成的门诊和住院花费数百亿元，远高于其他慢性病的医疗费用，是卫生总费用上涨的重要因素之一。
[0003]培美曲塞是一种结构上含有核心为吡咯嘧啶基团的抗叶酸制剂，通过破坏细胞内叶酸依赖性的正常代谢过程，抑制细胞复制，从而抑制肿瘤的生长。
[0004]药物代谢动力学是研究药物在生物体内的吸收、分布、代谢与排泄过程及规律的一门学科，与药效学研究药物对生物体的生物学活性相对应。药物代谢动力学侧重于研究机体对药物的处置，但随着学科的发展及研究技术水平的提高，药物对生物体的药物处置系统如转运体、代谢酶系的作用亦属于药物代谢动力学的研究范畴。药物在生物体内的处置特性在一定程度上决定了其药效或毒性作用强度，因而，药物代谢动力学研究在创新药物研究过程中具有十分重要的作用地位和意义。
[0005]在欧美等发达国家，药物代谢动力学研究已贯穿于创新药物研发的每一个环节，包括先导化合物的结构设计与优化、候选化合物的筛选与评价、候选药物的临床前评价与临床研究。国外近二十年的实践经验证明，药物代谢动专学研究的早期介入与系统研究是提高创新药物研发成功率、降低研发成本与风险、加快研发进程、实现临床安全合理用药的关键所在。
[0006]我国临床前药物代谢动力学研究与评价由于多种技术瓶颈限制，仅局限于在研发后期对部分药物原形进行初步的药物代谢动力学评价，评价内容主要包括药物原形的血浆经时过程、主要脏器分布及原形药的排泄途径的描述性研究。随着我国新药研发模式从以“仿制为主”向“仿创结合”及“创新为主”的转变，我国原有的药物代谢动力学研究评价体系已不能适应新药研发模式发展转变的需要，不能充分发挥药物代谢动力学研究在先导化合物的结构设计与优化、新药剂型设计与剂型改造、药物相互作用预测以及临床安全合理用药等方面的指导作用。
[0007]相比于欧美等发达国家，我国原有的药物代谢动力学研究发展滞后的根本原因在于关键技术水平的落后和研究体系不完善。集中体现在高灵敏度生物样品中微量药物的定量分析技术，体内外吸收、分布、代谢与排泄特性的快速预测、筛选与评价技术，药动学-药效学结合研究技术，药物相互作用预测与评价技术等相关关键技术的缺乏。
【发明内容】
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[0008]为此，精确地研究培美曲塞的药代动力学性质，了解其药物作用的规律性和毒性产生的物质基础，对指导临床制定合理的给药方案，提高临床用药的安全性和合理性具有关键作用和重要意义。
[0009]因此，本发明的目的是提供一套临床前药物代谢动力学关键技术与研究体系在培美曲塞的应用，以更精确研究培美曲塞的吸收、分布、代谢与排泄过程。
[0010]因此，本发明提供了临床前药物代谢动力学关键技术与研究体系在培美曲塞的应用，其包括:
[0011 ] (1)将一定浓度的培美曲塞给予实验动物一定时间后，收集血液、尿液和奠便中的一种或多种生物样品；
[0012](2)将步骤(1)中获得的生物样品采用液液萃取、蛋白沉淀、固相萃取技术进行处理，制成相应的溶液；
[0013](3)采用液相色谱-质谱(LC-MS)、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析步骤(2)中制备的溶液。
[0014]因此，本发明还提供了临床前药物代谢动力学关键技术与研究体系在培美曲塞的应用，其包括将一定浓度的培美曲塞给予实验动物一定时间后，收集血液，采用高效亲和色谱法测定培美曲塞与血浆蛋白的结合率。
[0015]因此，本发明还提供了临床前药物代谢动力学关键技术与研究体系在培美曲塞的应用，其包括将一定浓度的培美曲塞处理原代培养脑微血管内皮细胞，测定检测细胞形态、电阻值，以检测培美曲塞的血脑屏障通透性。
[0016]因此，本发明还提供了临床前药物代谢动力学关键技术与研究体系在培美曲塞的应用，其包括将一定浓度的培美曲塞处理Caco-2细胞，检测细胞形态、电阻值、培美曲塞的通透性和碱性磷酸酶活性，以检测培美曲塞的透膜性和细胞吸收能力。
[0017]因此，本发明还提供了临床前药物代谢动力学关键技术与研究体系在培美曲塞的应用，其包括将一定浓度的培美曲塞处理整体动物、S9、人肠肝微粒体及单克隆纯化酶，检测培美曲塞体外代谢稳定性及代谢产物的鉴定，通过结合LC-MS/MS，NMR技术，在定量分析的基础上对该药物可能的I相及II相代谢产物进行了鉴定。
[0018]本发明通过提供了临床前药物代谢动力学关键技术与研究体系在培美曲塞的应用，采用高通量、高灵敏度定量分析技术，提高了培美曲塞的灵敏度，为相关药代性质研究奠定了技术基础。同时本发明运用新的高效亲和色谱法测定培美曲塞在注射后的血浆蛋白结合率，以检测培美曲塞在体内的吸收、转运及分布特性。药物血浆蛋白结合率是药物与血浆蛋白结合的量占药物总浓度的百分率，是药物代谢动力学的重要参数之一;它影响药物在体内的分布、代谢与排泄，从而影响其作用强度和时间，并往往与药物的相互作用及作用机制等密切相关。因此，药物血浆蛋白结合率的研究对于指导临床合理用药都具有重要意义。此外，本发明还运用Caco-2细胞模型，对其透膜性和细胞吸收能力进行了评价;还采用原代培养脑微血管内皮细胞测定检测细胞形态、电阻值，以检测培美曲塞的血脑屏障通透性。最后，检测了培美曲塞体外代谢稳定性及代谢产物。
【具体实施方式】
[0019]本发明提供了临床前药物代谢动力学关键技术与研究体系在培美曲塞的应用，其包括:
[0020](1)将一定浓度的培美曲塞给予实验动物一定时间后，收集血液、尿液和奠便中的一种或多种生物样品；
[0021](2)将步骤(1)中获得的生物样品采用液液萃取、蛋白沉淀、固相萃取技术进行处理，制成相应的溶液；
[0022](3)采用液相色谱-质谱(LC-MS)、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析步骤⑵中制备的溶液。
[0023]本发明所述试验动物可以是大鼠、小鼠、豚鼠、兔或犬。
[0024]所述一定浓度和一定时间根据实验动物确定。
[0025]在一种优选的实施方式中，在步骤(2)中，所述液液萃取采用乙酸乙酯和氨水的混合物(例如，氨水在混合物中的浓度为10 % )以及乙酸乙酯和氢氧化钠(例如，氢氧化钠在混合物中的浓度为0.15M)的混合物;所述蛋白沉淀采用甲醇沉淀、乙腈沉淀、甲醇和乙腈的混合物沉淀，甲醇和乙腈的体积比为例如1:1.5。
[0026]在一种优选的实施方式中，在步骤(3)中，通过系统优化流动相组成、流动相梯度流速、质谱离子化条件，以提高对培美曲塞定量分析的灵敏度；而且极大地提高了分析通量，为培美曲塞的药物代谢动力学研究打下了坚实的分析技术基础。
[0027]鉴于脑靶向药物脑分布研究的重要性，脑靶向给药的药物需进行血脑屏障通透性的评价。本发明采用基于脑微血管内皮细胞的血脑屏障通透性研究模型，并通过形态学、电阻值、阳性药物转运、进一步检测培美曲塞的血脑屏障通透性。因此，在一种优选的实施方式中，该应用还包括将一定浓度的培美曲塞处理原代培养脑微血管内皮细胞，测定检测细胞形态、电阻值，以检测培美曲塞的血脑屏障通透性。
[0028]在一种优选的实施方式中，该应用还