混合 溶液，作为系统适用性溶液。
[0057] 另取帕立骨化醇对照品贮备液适量，用正己烷-异丙醇（体积比90:10)稀释，制 备成每lml中含帕立骨化醇约0. 005 μ g的溶液，作为灵敏度溶液。
[0058] 分别精密量取上述系统适用性溶液和灵敏度溶液各50 μ 1注入液相色谱仪，按照 上述的最佳的色谱条件进行测量，记录色谱图。系统适用性溶液的检测色谱图中帕立骨化 醇与杂质Α峰间分离度应大于3. 0 (因系统适用性试验中，只有主峰和杂质Α峰，杂质Α不 一定是与主峰最邻近的峰，参照USP37版帕立骨化醇原料药质量标准，定的两峰间分离度 应大于3. 0)，灵敏度色谱图中，帕立骨化醇峰的信噪比（S/N)应大于3. 0。
[0059] 系统适用性溶液的检测色谱图如图1所示，灵敏度溶液的检测色谱图如图2所示， 图中，纵座标是峰面积（单位：mV/mAU)，横座标是时间（单位：min)，以下色谱图无特殊说 明，纵座标均是峰面积（单位：mV/mAU)，横座标是时间（单位：min)。
[0060] 由图1可以看出，帕立骨化醇出峰时间为21. 167min，杂质A出峰时间为 23. 055min，两峰间分离度为4. 9,符合2010年版中国药典的要求。灵敏度色谱图中，帕立骨 化醇峰的信噪比（S/N)大于3.0。
[0061] 实施例3帕立骨化醇软胶囊的测定
[0062] 取帕立骨化醇软胶囊10粒的内容物混匀，作为供试品溶液。同时取空白基质（即 不含主药帕立骨化醇的空白基质）为对照溶液。
[0063] 分别精密量取供试品溶液和对照溶液各50 μ 1，注入液相色谱仪，按照实施例1中 确定的最佳色谱条件进行测定，记录色谱图。帕立骨化醇软胶囊供试品溶液检测的色谱图 如图3所示，图4为空白基质对照溶液的检测色谱图。由图4可以看出，帕立骨化醇软胶囊 空白基质在正相色谱系统中，由于溶解性差，基本不出峰，不干扰帕立骨化醇主峰及其有关 物质的检测。
[0064] 对帕立骨化醇软胶囊供试品溶液检测的色谱图进行分析，色谱图中如显杂质峰 (相对主峰保留时间0. 7以前的溶剂峰及辅料峰除外），按峰面积归一化计算各杂质的相对 含量，单个杂质的量不得超过1. 〇%，杂质总量不得超过2. 0 %。供试品溶液色谱图中任何 小于0. 1 %的峰可忽略不计，帕立骨化醇软胶囊供试品溶液检测的色谱图分析结果如表2 所示。
[0065] 表2帕立骨化醇软胶囊的分离测定结果
[0066]
[0067] 实施例4帕立骨化醇原料药的检测
[0068] 称取帕立骨化醇原料药粗品约20mg，置10ml量瓶中，加无水乙醇使溶解并稀释至 刻度，精密量取5ml，至50ml量瓶中，用正己烷-异丙醇（体积比90:10)稀释至刻度，摇 匀，配制成每lml含帕立骨化醇200 μ g的溶液，作为帕立骨化醇原料药供试品溶液，精密量 取帕立骨化醇原料药供试品溶液50 μ 1，注入液相色谱仪，按照实施例1中确定的最佳色谱 条件进行测定，记录色谱图，如图5所示。由图5可以看出，帕立骨化醇原料药粗品中各杂 质均能有效分离，帕立骨化醇与邻近峰的分离度为1.8,满足检测要求（因原料药粗品中， 有较多杂质，与主峰邻近的也不是杂质Α峰，只需满足帕立骨化醇与邻近峰的分离度大于 1. 5 (液相色谱中的基线分离条件）就行）。
[0069] 对帕立骨化醇原料药供试品溶液的色谱图进行分析，按峰面积归一化法计算其含 有的各杂质的相对含量，结果如表3所7K。
[0070] 表3帕立骨化醇原料药的分离测定结果
[0071]
[0072] 对比实施例1
[0073] 参照USP37版帕立骨化醇原料药质量标准中有关物质检测方法对帕立骨化醇软 胶囊进行检测。
[0074] USP37版帕立骨化醇原料药质量标准的检测条件如下：
[0075] 色谱柱：十八烷基键合硅胶色谱柱（4. 6 X 250mm，5 μ m);
[0076] 检测波长：252nm ;
[0077] 流速：2. Oml/min ;
[0078] 稀释剂：乙醇水溶液（其中乙醇与水的体积比为50 :50);
[0079] 流动相A :乙腈-水（乙腈与水的体积比为5:95);流动相B :乙腈，按表4的条件 进行梯度洗脱。
[0080] 表4USP37版帕立骨化醇原料药质量标准的检测条件（梯度洗脱表）
[0081]
[0082] 取帕立骨化醇软胶囊10粒的内容物混匀，作为供试品溶液。同时取空白基质（即 不含主药帕立骨化醇的空白基质）为对照溶液。
[0083] 分别精密量取供试品溶液和对照溶液各50 μ 1，注入液相色谱仪，按照本实施例中 USP37版帕立骨化醇原料药质量标准的检测条件进行测定，记录色谱图。帕立骨化醇软胶囊 供试品溶液检测的色谱图如图3所示，图4为空白基质对照溶液的检测色谱图。帕立骨化 醇软胶囊采用USP37版帕立骨化醇原料药质量标准检测的色谱图如图6所示，帕立骨化醇 软胶囊空白基质采用USP37版帕立骨化醇原料药质量标准检测得到的色谱图如图7所示。 由图7可以看出，帕立骨化醇软胶囊空白基质在该反相梯度洗脱程序中，出了较多较大的 辅料峰，且有些辅料峰间，无法达到有效分离，会干扰了有关物质的检测；由图6可以看出， 紧邻帕立骨化醇主峰有辅料峰，干扰了主峰的检测。
[0084] 对比实施例2
[0085] 参照USP37版帕立骨化醇原料药质量标准中有关物质检测方法对帕立骨化醇原 料药粗品进行检测。
[0086] 称取帕立骨化醇原料药粗品约20mg，置10ml量瓶中，加无水乙醇使溶解并稀释至 刻度，精密量取5ml，至50ml量瓶中，用乙醇水溶液（其中乙醇与水的体积比为50 :50)稀释 至刻度，摇匀，配制成每lml含帕立骨化醇200 μ g的溶液，作为帕立骨化醇原料药供试品溶 液，精密量取帕立骨化醇原料药供试品溶液50 μ 1，注入液相色谱仪，按照对比实施例1中 USP37版帕立骨化醇原料药质量标准的检测条件进行测定，记录色谱图，如图8所示。
[0087] 对图8的色谱图进行分析，按峰面积归一化法计算其含有的各杂质的相对含量， 结果如表5所示。与实施例4相比较，帕立骨化醇原料药粗品采用正相梯度HPLC法以及反 相梯度洗脱方法，杂质的检出个数以及检测水平基本一致。
[0088] 表5帕立骨化醇原料药的分离测定结果（USP37版帕立骨化醇质量标准）
[0089]
[0090] 由实施例3-4及对比实施例1-2可以得知，USP37版帕立骨化醇原料药质量标准 中有关物质检测方法对帕立骨化醇原料药粗品进行检测可以比较准确的检测出有关物质， 但是USP37版帕立骨化醇原料药质量标准中有关物质检测方法不适用于帕立骨化醇软胶 囊有关物质的检测；本发明的方法解决了 USP37版的缺陷，既能很好的适用于帕立骨化醇 原料药粗品有关物质的检测，又能快速准确检测帕立骨化醇软胶囊有关物质。
[0091] 最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较 佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技 术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本 发明的权利要求范围当中。
【主权项】
1. 一种HPLC法分离测定帕立骨化醇原料药及制剂中有关物质的方法，其特征在于，所 述HPLC法为正相HPLC法，所述正相HPLC法分析过程中采用的色谱柱固定相的极性大于流 动相的极性。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述HPLC法具体为：制备供试品溶液，采 用高效液相色谱测定供试品溶液中各物质的峰面积，按照峰面积归一化计算各物质的相对 含量。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的色谱柱为硅胶填料的色谱柱， 所述硅胶填料粒径为3-5μm。4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的流动相是采用流动相A和流动相B 进行梯度洗脱，所述的流动相A为正己烷，所述的流动相B为正己烷与具2-3个碳原子的醇 的混合物。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述流动相B中醇与正己烷的体积比为 10-25 ：75-90〇6. 根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述醇为乙醇和/或异丙醇。7. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱的 条件为：0min，流动相A与流动相B的体积比为80 :20 ;2min，流动相A与流动相B的体积比 为80 :20 ;30min，流动相A与流动相B的体积比为25 :75 ;35min，流动相A与流动相B的体 积比为25 :75 ;35.Olmin，流动相A与流动相B的体积比为80 :20 ;50min，流动相A与流动 相B的体积比为80 :20。8. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述流动相的流速为0. 9-1.lml/min。9. 根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述色谱柱柱温为40-50°C，所述 HPLC法分析过程中采用的检测器为紫外检测器。10. -种正相HPLC法分离测定帕立骨化醇软胶囊有关物质的方法，其特征在于，所述 正相HPLC法分析过程中采用的色谱柱是以硅胶为填料，以流动相A和流动相B进行梯度洗 脱；所述的流动相A为正己烷，所述的流动相B为正己烷与醇的混合物，所述醇为乙醇和/ 或异丙醇；所述正相HPLC法分析过程包括制备帕立骨化醇软胶囊供试品溶液，采用高效液 相色谱测定供试品溶液中各物质的峰面积，按照峰面积归一化计算各物质的相对含量。
【专利摘要】本发明属于分析化学领域，具体涉及一种采用高效液相色谱法分离和测定帕立骨化醇原料药及制剂中有关物质的方法，所述的方法是采用正相液相色谱法，使用的色谱柱固定相的极性大于流动相的极性，采用该正相液相色谱法测定供试品溶液中各物质的峰面积，按照峰面积归一化计算各物质的相对含量。本发明的方法与现有技术相比，具有专属性强，帕立骨化醇与各杂质分离较好等特点，可用于帕立骨化醇原料药及其软胶囊制备过程中杂质的检测和质量控制。
【IPC分类】G01N30/02
【公开号】CN105467021
【申请号】CN201410441459
【发明人】管璐晗, 赵静, 陈李平
【申请人】重庆华邦制药有限公司
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2014年9月1日