检测cda基因第79、208和435位点的引物和方法
【技术领域】
[0001] 本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测CDA基因第79、208和435位点 的引物和方法。
【背景技术】
[0002] 吉西他滨是一种破坏细胞复制的二氟核普类抗代谢抗肿瘤药，在临床上广泛用 于非小细胞肺癌的一线治疗，同时对于包括胰腺癌、胆囊癌、乳腺癌和平滑肌肉瘤等在内 的其他许多实体瘤具有活性。但是，该药的治疗窗小，易引发以骨髓抑制为主的不良反应。 有研宄表明，编码胞苷脱氨酶CDA的基因序列中的单核昔酸多态性可能会影响吉西他滨的 血药浓度，进而影响其用药后的不良反应乃至疗效。有研宄表明CAD基因多态性位点包括 第79位点的突变A79C (即Lys27Gln)，第208位点的突变G208A (即Ala70Thr)和第435位 点的突变 C435T (即 Thr 145Thr)。
【发明内容】
[0003] 本发明提供检测CDA基因第79、208和435位点的引物，采用Sanger测序法，可用 于快速检测CDA基因第79、208和435位点突变的情况。
[0004] 本发明的目的之一在于提供检测CDA基因 A79C(Lys27Gln)，G208A(Ala70Thr) 和C435T(Thrl45Thr)位点的引物，包括：扩增覆盖检测CDA基因第A79C(Lys27Gln)， G208A(Ala70Thr)和C435T(Thrl45Thr)位点的正、反向引物和测序引物；其碱基序列为：
[0005] CDA79-F ：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGTGTGAAGCACACGTAGG ；
[0006] CDA79-R ：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGCGCCTCTTCCTGTACATC ；
[0007] CDA208-F ：TGTAAAACGACGGCCAGTCTCTGCTCTCTTCTCAGGGT ；
[0008] CDA208-R ：TGTAAAACGACGGCCAGTGTTGGCTAAAGAGATGAATG ；
[0009] CDA435-F ：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTCTCACGCCAGCTTTGCC ；
[0010] CDA435-R ：TGTAAAACGACGGCCAGTCTCAGGCTGGAGTGTAATCTG ；
[0011] 测序-F : TGTAAAACGACGGCCAGT ;
[0012] 测序-R :AACAGCTATGACCATG。
[0013] 进一步地，所述正、反向引物的使用浓度比为：CDA79-F:CDA79-R = 1:1,CDA7208-F:CDA208-R = I:I, CDA435-F:CDA435-R = 1:1〇
[0014] 进一步地，所述测序引物的使用浓度比为：测序-F:测序-R = 1:1。
[0015] 本发明的目的之二是提供一种检测检测CDA基因第A79C (Lys27Gln)， G208A(Ala70Thr)和C435T(Thrl45Thr)位点的方法，其包括如下步骤：
[0016] (1)提取样品 DNA ;
[0017] (2)利用扩增引物 CDA79-F/CDA79-R，CDA208-F/CDA208-R，CDA435-F/CDA435-R 对 (1)中的DNA分别进行扩增，获得检测CDA基因第A79C(Lys27Gln)，G208A(Ala70Thr)和 C435T(Thrl45Thr)位点的扩增产物；
[0018] (3)利用测序引物测序-F与测序-R对⑵中的扩增产物分别进行正向和反向测 序，获得所述扩增产物的基因序列；
[0019] (4)将（3)中的基因序列与野生型CDA基因序列进行比较，确定突变位点是否存 在；
[0020] 其中所述引物序列为：
[0021] CDA79-F ：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGTGTGAAGCACACGTAGG ；
[0022] CDA79-R ：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGCGCCTCTTCCTGTACATC ；
[0023] CDA208-F ：TGTAAAACGACGGCCAGTCTCTGCTCTCTTCTCAGGGT ；
[0024] CDA208-R ：TGTAAAACGACGGCCAGTGTTGGCTAAAGAGATGAATG ；
[0025] CDA435-F ：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTCTCACGCCAGCTTTGCC ；
[0026] CDA435-R ：TGTAAAACGACGGCCAGTCTCAGGCTGGAGTGTAATCTG ；
[0027] 测序-F :TGTAAAACGACGGCCAGT ;
[0028] 测序-R :AACAGCTATGACCATG。
[0029] 本发明的目的还在于提供一种检测CDA基因第79、208和435位点的试剂盒，所 述试剂盒包括样品DNA抽提试剂；无水乙醇；检测体系PCR反应液、测序体系反应液、阳性 对照品、阴性对照品和空白对照品，其中检测体系PCR反应液包括3对扩增引物CDA79-F/ CDA79-R，CDA208-F/CDA208-R，CDA435-F/CDA435-R，测序体系包括测序引物测序-F 与测 序-R，包括：
[0030] CDA79-F ：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGTGTGAAGCACACGTAGG ；
[0031] CDA79-R ：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGCGCCTCTTCCTGTACATC ；
[0032] CDA208-F ：TGTAAAACGACGGCCAGTCTCTGCTCTCTTCTCAGGGT ；
[0033] CDA208-R ：TGTAAAACGACGGCCAGTGTTGGCTAAAGAGATGAATG ；
[0034] CDA435-F ：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTCTCACGCCAGCTTTGCC ；
[0035] CDA435-R ：TGTAAAACGACGGCCAGTCTCAGGCTGGAGTGTAATCTG ；
[0036] 测序-F :TGTAAAACGACGGCCAGT ;
[0037] 测序-R :AACAGCTATGACCATG。
[0038] 进一步地，所述检测体系PCR反应液还包括2 X PCR Buffer ;dNTPs ;K0D FX DNA Polymerase。
[0039] 进一步地，所述测序体系还包括测序纯化液、EDTA、无水乙醇、75%乙醇、HIDI和 Bigdye Terminator V3.1〇
[0040] 进一步地，所述测序纯化液包括虾碱性磷酸酶和核酸外切酶I。
[0041] 本发明的有益效果是：本发明设计了扩增覆盖检测CDA基因第79、208和435位 点的正、反向引物，并创新性的在PCR扩增上游引物前端和下游引物前端分别加了一段长 18bp的测序引物的正向引物序列和长16bp的测序引物的反向引物序列。这样扩增以后的 产物两端都会带上所引入的所述的测序引物序列，随后进行测序反应的时候，所有的扩增 产物可以使用相同的测序引物就可以完成不同基因的正反向测序，很大程度的节省了检测 成本。对送检样本进行PCR扩增，采用Sanger测序法，对PCR产物进行正反向测序反应扩 增、纯化后变性、直接测序可以全面地检测CDA基因第79、208和435位点的突变情况。通 过调整正反向引物的浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。
[0042] 另一方面利用本发明所述扩展引物和测序引物，可以扩增包含第79、208和435位 点，通过测序结果的分析，可以很直观的了解CDA基因第79、208和435位点基因突变情况， 并不受CDA基因突变多样化以及没有突变热点的影响，可覆盖待检测的所有突变位点；具 有很高的特异性及准确性；采用PCR方法扩增目的基因并测序检测其基因多态性，具有灵 敏度高，操作简单、成本低等优点。
【附图说明】
[0043] 图1样品ICDA基因第79位点正向测序结果图。
[0044] 图2样品2CDA基因第79位点正向测序结果图。
【具体实施方式】
[0045] 下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明 的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编 的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
[0046] 实施例1
[0047] 检测CDA基因第79、208和435位点的引物，包括：扩增覆盖检测CDA基因第 79、208和435位点的正、反向引物；其中测定第79位点的正反向引物分别为CDA79-F和 CDA79-R，测定第208位点的引物分别为CDA208-F和CDA208-R，测定第435位点的引物为 CDA435-F和CDA435-R。所述扩展引物的碱基序列具体包括：
[0048]
[0049] 所述引物还包括测序的正反向引物测序-F和测序-R，其碱基序列为
[0050] 测序-F :TGTAAAACGACGGCCAGT
[0051] 测序-R :AACAGCTATGACCATG。
[0052] 在检测中，先利用上述正、反向引物对覆盖检测CDA基因第79、208和435位点的 DNA片段进行扩增，获得扩增产物，然后利用上述测序引物对扩增产物进行测序，获得扩增 广物的基因序列。
[0053] 检测检测CDA基因第79、208和435位点的试剂盒，包括：组织DNA抽提试剂盒（例 如使用天根生物的提取试剂盒）；无水乙醇；检测体系PCR反应液、测序体系反应液、阳性对 照品、阴性对照品和空白对照品，其中
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