可用于检测与大肠癌相关的sstr2基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种辅助诊断大肠癌的检测试剂盒，尤其是涉及一种可用于检测与大 肠癌相关的基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 大肠癌（Colorectal Cancer，CRC)又称结直肠癌，是消化系统中常见的恶性肿瘤。 目前研宄表明大肠癌是大肠黏膜上皮细胞在遗传和环境等多种复杂的因素共同作用下，发 生遗传和表观遗传的改变而获得无限增殖，躲避凋亡程序等能力，从而在局部形成肿块。近 年来，随着人们生活水平的提高，饮食习惯与结构的改变，加之人口老龄化趋势的影响，我 国大肠癌的发病率和死亡率增长迅速，而且，发病年龄明显提前。世界卫生组织（WHO)发布 的《全球癌症报告2014》显示中国癌症新增病例和死亡人数的绝对数值位居世界首位。其 中以胃癌、食道癌、大肠癌为代表的消化道癌症威胁最为显著。尽管目前手术方式和辅助治 疗手段不断改进，大肠癌的患者的术后生存情况有了较大的改善，但是CRC患者的五年总 体生存率仍旧不高，其中最重要的一个因素就是，许多患者在疾病发生的早期没有得到及 时的诊断和治疗。因此，有必要探索其他分子指标独立或者联合CEA等检测，对大肠癌患者 做到早发现，早诊断，早治疗，提高大肠癌患者总体生存率。
[0003] 生长抑素受体2 (somatostatin receptor 2，51^77?)是生长抑素受体家 族（somatostatin receptors，51?/??)中的一员。生长抑素受体家族（somatostatin receptors，必7T&)是一类介导生长抑素及其类似物，具有多种生物学效应的C蛋白偶联 受体家族，包括5^77(7、5^77?#以及5?Π ，可以通过cAMP、PTP和MAPK信号通 路，在调控GH分泌、诱导细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增生、抑制胰岛素作用和抑制细胞生长等 生物学过程发挥重要作用。生长抑素受体2蛋白（somatostatin receptor 2，51^77?)是 位于17号染色体的生长抑素受体2基因（chrl7:71，161，160-71，168,062)编码产物。生 长抑素受体2蛋白在调控动物的生长过程中起主要作用，主要抑制GH、胰岛素释放，参与介 导肿瘤的抗增殖作用以及诱导细胞凋亡，是介导抗肿瘤作用的主导亚型。国外有研宄表明 在多种人类细胞株中，生长抑素受体2(somatostatin receptor 2,51^77?)基因的表达受启 动子区DNA甲基化表观遗传调控。但是目前，国内外还没有公开任何关于在大肠癌中用于 检测生长抑素受体2基因启动子区甲基化程度的检测试剂盒相关研宄报道。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一种检测方便、针对性强、检测准确率高的可 用于检测与大肠癌相关的基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用，其中基因 必77PJ?甲基化水平与大肠癌的患病率呈正相关，可通过对样品DNA甲基化水平测定辅助诊 断大肠癌。
[0005] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种可用于检测与大肠癌相关的 基因启动子区甲基化程度的试剂盒，包括基因启动子区的甲基化特异性扩增 上游引物、下游引物及其甲基化特异性测序引物，其中所述的甲基化特异性扩增上游引物 的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示： 5' -Biotin -AGGGTAGAGGAGTTAGGAATTT-3' ； 所述的甲基化特异性扩增下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示： 5' -ACCCCTCACCTTTACTTTTC-3' ； 所述的甲基化特异性测序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示： 5' -ACCCAACCACTATCCC-3'。
[0006] 一种可用于检测与大肠癌相关的基因启动子区甲基化程度的试剂盒的应 用，该试剂盒可用于大肠癌辅助检测、诊断或药物治疗中。
[0007] 与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首次公开了可用于检测与大肠癌相 关的基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用，所述的检测试剂盒包含生长抑素 受体2基因 （somatostatin receptor 2，5577?)启动子区的甲基化特异性上游引物、甲基 化特异性下游引物及其甲基化特异性测序引物。生长抑素受体2基因启动子区域的高甲基 化，影响转录因子与DNA间的相互作用，或改变染色质结构从而导致生长抑素受体2基因的 低表达，从而影响大肠癌的发生和发展。因此，生长抑素受体2基因启动子区甲基化水平与 大肠癌的患病率呈正相关，通过检测生长抑素受体2基因启动子区甲基化程度辅助诊断大 肠癌，简单、方便，检测效率高，针对性强，具有准确可靠、灵活快速和经济节约的优点，有利 于大肠癌的早期发现和及时治疗。
[0008] 综上所述，以基因必77?」?启动子区域甲基化水平为基础的诊断试剂盒可以方便快 捷地在分子水平上实现对大肠癌的检测，同时，以必TTPi基因启动子区域DNA甲基化为靶点 的药物有望成为大肠癌辅助诊断、检测和筛选的一种新手段。
【附图说明】
[0009] 图1为被检测序列所在区域(具体位置为chrl7:71，161，315-71，161，371)，以及 所检测的9个CpG点之间的关联性分析结果(例如CpGl与CpG2的相关系数为0. 885,CpG2 与CpG3的相关系数为0. 894)); 图2为DNA甲基化水平检测结果示意图（如图示CpGl到CpG9的甲基化程度分别为35%， 31%，33%，30%，21%，36%，28%，25%，11%);图中阴影部分显示的是对应CpG位点的信号强度， 结合该位点附近碱基种类可分析得到其甲基化水平（即阴影框对应的上方数字)。
【具体实施方式】
[0010] 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。 具体实施例
[0011] 1、研宄对象的收集 本研宄选取宁波市某三甲医院手术切除的大肠癌患者42例手术标本作为研宄对象。 所有病例诊断，依据患者的临床资料、影像学和结肠镜检查等，并得到术后病理诊断确认。 手术切除大肠癌组织和癌旁组织（距离癌组织至少5cm以上的正常组织）立即保存于-80 度液氮，用于日后组织标本全基因组DNA提取。所有研宄对象都签署知情同意书。
[0012] 2、基因组DNA的提取 采用QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden,德国）DNA提取试剂盒提取组织全基因 组DNA，再通过NanoDrop2000超微量分光光度计（美国，Thermo Fish