可用于检测与喉癌相关的shisa3基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种辅助诊断喉癌的检测试剂盒，尤其是涉及一种可用于检测与喉癌 相关的基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 喉癌（Laryngeal carcinoma，LC)是耳鼻咽喉科最常见的恶性肿瘤，其发病率位于 呼吸系统肿瘤的第二位，在世界范围内，居于全身恶性肿瘤的第十一位，约占全球每年新发 恶性肿瘤的1-2. 5%，其中喉鳞状细胞癌约占90%。目前研究表明喉癌的发生发展是受生活 习惯、环境因素、遗传和表观遗传学等多种复杂的因素影响的多阶段过程。近年来，随着环 境因素恶化、人们生活水平的提高等影响，我国喉癌的发病率和死亡率增长迅速，而且发病 年龄明显提前。由于喉癌的早期症状不明显，许多患者在疾病发生的早期没有得到及时的 诊断和治疗，确诊时患者多数已进入中、晚期，对喉癌的治疗和预后带来了极差的影响。虽 然近年来影像学、分子检测等辅助诊断技术发展迅速，但目前经纤维喉镜活检仍是喉癌诊 断的金标准。.尽管近几十年来外科技术和辅助治疗得到不同程度的提高，但是目前喉癌的 五年生存率仍未明显增长，原因之一就是目前喉癌发病的分子学机制仍不清楚，早期诊断 及治疗不理想。因此，有必要探索具有高敏感性和特异性的分子检测指标，对喉癌患者做到 早发现，早诊断，早治疗，提高喉癌患者总体生存率。
[0003] Shisa 家族成员 3 (shisa family member 3, SHISA3)位于 4 号染色 (chr4:42, 399, 856-42, 404, 504)。有研究表明 Shisa 家族成员 3 (shisa family member 3，SHISA3)可通过干扰Wnt信号通路中重要因子β-catenin的稳定性，从而发挥抑制肺 癌的发生及转移的重要作用。同时，国外有研究人员通过焦磷酸测序发现在大肠癌中Shisa 家族成员3启动子区高甲基化是调节Shisa家族成员3蛋白表达的的重要机制，并可作为 一个独立的不良预后指标。但是目前，国内外尚无关于喉癌与似·?基因启动子区甲基化 相关性研究和在喉癌中用于检测基因启动子区甲基化程度的检测试剂盒相关研究 报道。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一种检测方便、针对性强、检测准确率高的可 用于检测与喉癌相关的似·?基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用，其中基因 J甲基化水平与喉癌的患病率呈正相关，可通过对样品DNA甲基化水平测定辅助诊断 喉癌。
[0005] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种可用于检测与喉癌相关的 基因启动子区甲基化程度的试剂盒，包括基因启动子区甲基化特异性扩增 上游引物、下游引物及其非甲基化特异性扩增上游引物和下游引物，其中所述的甲基化特 异性扩增上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示： 5' _ AGAGGTGATCGGTAATTTTTTAGTC-3' ； 所述的甲基化特异性扩增下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示： 5' - CCTATTACACAAACTCAAACTCGTT-3' ； 所述的非甲基化特异性扩增上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示： 5' - GAGGTGATTGGTAATTTTTTAGTTG-3' ； 所述的非甲基化特异性扩增下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示： 5' - CCTATTACACAAACTCAAACTCATT-3'。
[0006] -种可用于检测与喉癌相关的J基因启动子区甲基化程度的试剂盒的应 用，该试剂盒可用于喉癌辅助检测、诊断或药物治疗中。
[0007] 与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首次公开了可用于检测与喉癌相关 的基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用，所述的检测试剂盒包含基 因启动子区的甲基化特异性扩增上游引物、甲基化特异性扩增下游引物及其非甲基化特异 性扩增上游引物、非甲基化特异性扩增下游引物。您/从堪因启动子区域的高甲基化，影响 转录因子与DNA间的相互作用，或改变染色质结构从而导致J基因的低表达，从而影 响喉癌的发生和发展。因此，基因启动子区甲基化情况能用作喉癌恶性程度和预后 评价的分子生物学标记，以检测喉癌基因启动子区甲基化水平为基础的诊断试剂 盒可以方便快捷地在分子水平上实现对喉癌的检测，对喉癌恶性程度和预后判断，检测效 率高，针对性强，具有准确可靠、灵活快速和经济节约的优点，有利于喉癌的早期发现和及 时治疗。
【附图说明】
[0008] 图1为PCR产物琼脂糖凝胶电泳成像图。
【具体实施方式】
[0009] 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。 具体实施例
[0010] 1、研究对象的收集 本研究选取宁波市某三甲医院手术切除的喉癌患者93例手术标本作为研究对象。所 有病例诊断，依据患者的临床资料、影像学和纤维喉镜检查等，并得到术后病理诊断确认。 手术切除喉癌组织和癌旁组织(距离癌组织至少5cm以上的正常组织)立即保存于-80度液 氮，用于日后组织标本全基因组DNA提取。所有研究对象都签署知情同意书。
[0011] 2、基因组DNA的提取 采用QIAamp DNAMini Kit (Qiagen, Hilden,德国）DNA提取试剂盒提取组织全基因 组DNA，再通过NanoDrop2000超微量分光光度计（美国，Thermo Fisher Scientific)检测 所得DNA的浓度，以供J基因启动子区DNA甲基化水平的检测。
[0012] 3、DNA甲基化测定 本实验采用甲基化特异性链式聚合反应技术对基因启动子区序列进行了 DNA甲基化测定。此技术的基本原理：用重亚硫酸盐处理DNA样品后，再应用聚合酶链反 应（PCR)扩增，可使发生甲基化的胞嘧啶（C)碱基保持不变，而使未发生甲基化的胞嘧 啶（C)转变成了尿嘧啶（U)，然后通过甲基化特异性引物能且只能与甲基化样本结合进行 PCR反应，而未甲基化特异性引物能且只能与未发生甲基化样本结合进行PCR反应，从而 得出样本是否甲基化。本次研究米用MethPrimer (http://www.urogene.org/cgi_bin/ methprimer/