检测肺癌kif5b-ret融合基因的引物、试剂盒及其使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种检测肺癌KIF5B-RET融合基因的引物、试剂 盒及其使用方法。
【背景技术】
[0002] 肺癌是中国发病率和死亡率最高的癌症之一，对人群健康和生命威胁很大。不少 肺癌患者存在癌基因的突变，这些驱动突变通过持续的激活信号蛋白，对肺癌的形成和维 持产生重要影响。这些代表性癌基因有EGFR、HER2、KRAS、ALK、BRAF、PIK3CA、AKTl、ROSl、 NRAS和MAP2K1等。上述很多基因的突变状态与靶向药物的敏感性相关，如EGFR基因的一 些突变对酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼和厄洛替尼敏感，而对ALK抑制剂克唑替尼耐受，但 存在ALK或ROSEl融合基因的患者则对克唑替尼治疗敏感，而耐受吉非替尼和厄洛替尼。可 见相关癌基因的突变状态对靶向药物的选择治疗有着重要的指导作用。
[0003] 有接近一半的肺癌患者仍存在未知的临床相关的癌基因突变，RET基因融合是较 新发现的一种肺癌驱动突变，与EGFR、KRAS等突变互斥，代表一种新的分子亚型，其突变人 群约占肺癌人群的1 %。KIF5B-RET融合导致RET的异常激活，从而激活下游细胞内信号通 路，导致细胞异常。故对RET融合基因（KIF5B-RET)的筛查，可对肺癌进行分子分型，并对 靶向药物（凡德他尼）用药作出指导。
[0004] 目前对融合基因的检测方法较多，有荧光原位杂交（FISH)、PCR产物电泳、测序等 方法，但以上方法存在诸多弊端，如FISH检测周期较长且所需探针等试剂昂贵；PCR产物电 泳经常会造成样本污染问题，且对弱阳性样本的评判存在人的主观性；测序则对样本质量 要求较高，检测周期长，方法灵敏度较低。
【发明内容】
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种检测肺癌KIF5B-RET融合基 因的引物，本发明还公开了包括有所述引物的试剂盒及其使用方法。
[0006] 本申请的发明人根据四种KIF5B-RET融合亚型，设计了四对特异引物，采用SYBR GREEN I染色real time-PCR的方法，可以快速、准确地定性检测肺癌石蜡组织或新鲜组织 的KIF5B-RET融合基因。
[0007] 根据本发明的实施例，提供了一种用于检测肺癌KIF5B-RET融合基因的引物，所 述引物包括5对引物，可同时扩增四种融合亚型和一个内参基因。
[0008] 所述KIF5B-RET融合的四种融合亚型为：K15 ;R12亚型、K16 ;R12亚型、K22 ;R12 亚型、K23 ;R12亚型。
[0009] 特异性扩增K15 ;R12亚型的引物序列如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2所示，
[0010] SEQ ID N0:1 5'-AGACCTTGCAGAAATAGGAATTG-3'
[0011] SEQ ID N0:2 5' -TCCAAATTCGCCTTCTCCTA-3'
[0012] 特异性扩增K16 ;R12亚型的引物序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID N0:4所示，
[0013] SEQ ID NO:3 5' -GAGTTAGCAGCATGTCAGCTTC-3'
[0014] SEQ ID N0:4 5' -TCCAAATTCGCCTTCTCCTA-3'
[0015] 特异性扩增K22 ;R12亚型的引物序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示，
[0016] SEQ ID N0:5 5' -CGCAAACTCTTTGTTCAGGA-3'
[0017] SEQ ID N0:6 5' -TCCAAATTCGCCTTCTCCTA-3'
[0018] 特异性扩增K23 ;R12亚型的引物序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示，
[0019] SEQ ID N0:7 5' -ATCTCCTTTCTTGAAAATAATCTTG-3'
[0020] SEQ ID N0:8 5' -TCCAAATTCGCCTTCTCCTA-3'
[0021] 特异性扩增内参基因的引物序列如SEQ ID N0:9和SEQ ID NO: 10所示，
[0022] SEQ ID N0:9 5' -CGCCCGCCGCGGCTTGTCCCGAGATGTTTAT-3'
[0023] SEQ ID N0:10 5' -CGCCCGCCGCCACAGCAGGACACCAAAAGA-3'。
[0024] 根据本发明的实施例，还提供了一种用于检测肺癌KIF5B-RET融合基因的试剂 盒，其主要包括：分别装有用于检测肺癌KIF5B-RET融合基因四种融合亚型以及一种内参 基因的5对引物的试剂管，引物序列如SEQ ID NO: 1~SEQ ID NO: 10所示；装有荧光定量 taq酶的试剂管；装有ROX染料试剂的试剂管；装有去离子水的试剂管；分隔并集中包装这 些试剂管的包装盒。
[0025] 所述荧光定量taq酶为本领域常规的在实时荧光定量PCR中使用的荧光定量taq 酶试剂，优选的，所述焚光定量taq酶为宝生物公司的SYBR_? Premix Ex TaqTM II(2X) 试剂。
[0026] 所述ROX染料试剂为本领域常规的在实时荧光定量PCR中使用的ROX染料试剂， 优选的，所述ROX染料试剂为宝生物公司的ROX Reference Dye or Dye II (50X)试剂。
[0027] 本发明的引物和试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
[0028] (1)使用常规方法提取待测样本的RNA并进行反转录，得到cDNA ;
[0029] (2)以步骤⑴得到的cDNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，在扩增时，以确定携 带相应KIF5B-RET融合基因亚型的样本为阳性对照，以去离子水为阴性对照；
[0030] (3)分析得到的扩增曲线图：若无扩增曲线升起，则为KIF5B-RET融合基因阴性； 若有扩增曲线跳起，则将其与阳性对照的峰值Tm值对比，若样本与阳性对照的峰值Tm值相 同，则为KIF5B-RET融合基因阳性，若不同，则为KIF5B-RET融合基因阴性。
[0031] 通过以上技术方案，本发明的有益效果如下：
[0032] 本检测方法针对最常见的四种KIF5B-RET融合亚型，设计四对特异引物及一对内 参引物，采用SYBR GREEN I染色real time-PCR的方法，来定性检测肺癌石蜡组织或新鲜 组织KIF5B-RET融合基因，包括K15 ;R12、K16 ;R12、K22 ;R12、K23 ;R12四种融合亚型，这四 种融合亚型占到已报道融合病例的94. 4%。本发明的检测具有成本低，检测周期短，灵敏度 尚，不易污染等诸多优点。
【具体实施方式】
[0033] 下面结合实施例对本发明的【具体实施方式】作进一步描述，本发明的优点和特点将 会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是示范性的，并不对本发明的范围构成任何限制。
[0034] 下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0035] 下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0036] 实施例检测肺癌KIF5B-RET融合基因的试剂盒及其使用方法
[0037] 1.该用于检测肺癌KIF5B-RET融合基因的试剂盒中装有：
[0038] (1)引物
[0039] 特异性扩增K15 ;R12亚型的引物序列如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2所示，
[0040] SEQ ID N0:1 5'-AGACCTTGCAGAAATAGGAATTG-3'
[0041] SEQ ID N0:2 5' -TCCAAATTCGCCTTCTCCTA-3'
[0042] 特异性扩增K16 ;R12亚型的引物序列如SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO:4所示，
[0043] SEQ ID N0