鉴定小麦叶锈菌生理小种thts特异引物应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于鉴定小麦叶锈菌生理小种的引物序列及其应用。
【背景技术】
[0002] 由小麦叶锈菌引起的小麦叶锈病是世界麦区普遍发生的 病害之一，其发生与流行使小麦产量和品质受到严重影响，是影响世界小麦生产的重要障 碍。由于小麦品种和发病时期不同，可造成7%-30%，甚至50%以上产量损失（Huerta-Espino et al. 2011)。实践证明，控制该病害最经济、安全、有效方法是抗病品种的应用。但品种抗 叶锈性的丧失是抗病品种应用的一个严重问题，其主要原因是叶锈菌变异和新毒性小种 的产生。因此，小麦叶锈菌生理小种监测及流行预报已成为防治小麦叶锈病、指导小麦抗病 品种选育和布局的重要环节。但小麦叶锈菌是一种专性寄生菌，无法进行人工培养，而 生理小种的常规鉴定与监测方法繁杂、费工费时，准确性也易受到鉴定条件的影响，因 此，需寻找一种简便、快速、准确性高的新方法。
[0003] 目前，DNA标记技术已广泛用于真菌群体生物学、流行学研究。RAPD、RFLP、AFLP和 SSR分子标记已广泛应用于小麦叶锈菌群体遗传结构研究。其中SSR标记因其多态性高、共 显性、稳定性好而得到了广泛应用，但目前小麦叶锈菌生理小种特异性的分子标记还很少， 无法利用DNA分子标记进行快速的小种鉴定。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种用于鉴定小麦叶锈菌生理小种的引物序列， 用于快速鉴定待测小麦叶锈菌生理小种类型。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明所述引物序列为Ptssr0125,由序列表中上游序列 (20个碱基）和下游序列（20个碱基）组成，表1。
[0006] 表1用于检测抗叶锈基因的两引物上下游序列
本发明所提供的用于鉴定小麦叶锈菌生理小种的分子标记是PtSSr〇125,由引物 Ptssr0125扩增获得200 bp和178bp条带。
[0007] 本发明还提供了引物序列在筛选小麦叶锈菌生理小种中的应用。
[0008] 本发明应用的具体方法为：以待测小麦叶锈菌基因组DNA为模板，利用引物 Ptssr0125进行PCR扩增，再对扩增产物进行检测；当扩增产物同时有200bp和178bp条带 时，则待测小麦叶锈菌株的生理小种类型为THTS。
[0009] 本发明应用中所述的PCR扩增： 20 μL PCR反应体系为：模板DNA 60 ng，Taq酶0.5 U，上、下游引物（5 μ mol ·〇 各0.4 μ L，dNTP (10 mmol ?I/1 )0. 4 μ L，10 X PCR缓冲液2 μ L，用无菌超纯水补充反 应体系至20 yL; PCR 反应程序为：先 94 °C 5 min;然后 94 °C 30 s，55°C 30 s，72°C I min，共 35 个 循环；最后72 °C 5 min，4°C保存。
[0010] 本发明应用中所述的对扩增产物进行检测是：对扩增产物在10% (w/v)的非变性 聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，然后银染显色。
[0011] 采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明提供了一个新的小麦叶锈菌生 理小种THTS的EST-SSR特异标记，利用该标记可快速鉴定、监测生理小种THTS，从而为建立 具有实用价值的中国小麦叶锈菌生理小种的分子监测技术体系奠定基础。
【附图说明】
[0012] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明。
[0013] 图1是用EST-SSR引物Ptssr0125对14个生理小种21个菌株的PCR扩增结果。 各泳道中，M代表分子量标准，1-21表示213个小麦叶锈菌株中的21个，其中11和12菌株 为THTS生理小种，2和19菌株为THTT生理小种，3,9,15和18菌株为THST生理小种，其它 泳道各代表一种生理小种。
【具体实施方式】
[0014] 用于鉴定小麦叶锈菌生理小种THTS的引物，是由序列表中引物Ptssr0125的上下 游核苷酸序列组成的引物对。
[0015] 应用本引物序列鉴定小麦叶锈菌生理小种THTS的具体方法如下： 1、 提取待测小麦基因组DNA为模板； 2、 以Ptssr0125为引物、待测小麦叶锈菌基因组DNA为模板，进行PCR扩增。20 μL PCR 反应体系为：模板DNA 60 ng，Taq酶0.5 U，上、下游引物（5 μ mol· Γ1)各0.4 μ L，dNTP (10 mmol ?ΟΟ. 4 yL，10 X PCR缓冲液2 yL，用无菌超纯水补充反应体系至20 yL; 反应程序是94 °C预变性5min，随后进行35个循环：94°C变性30 s，55°C退火30 s，72°C延 伸I min ;72°C延伸5 min，最后4°C保存。
[0016] 3、对扩增产物进行分离检测：在扩增产物中加入非变性载样指示剂，在浓度为 10% (w/v)的非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，银染显色，若扩增产物中含有200bp和 178bp大小的条带，则待测小麦叶锈菌的致病类型为THTS。所述非变性载样指示剂组成为： 0.25% (w/v)溴酚蓝，0.25% (w/v)二甲苯腈和40% (w/v)蔗糖，溶剂为蒸馏水。
[0017] 下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所有引物合成均由华大基因 生物技术有限公司完成。
[0018] 实验例： 小麦叶锈菌生理小种THTS，EST-SSR标记Ptssr0125的获得： 选用21对EST-SSR引物，所有引物序列源自Wang ei a乂 2010年开发的小麦叶锈菌 EST-SSR引物，以213个小麦叶锈菌菌株的基因组DNA为模板，进行PCR检测，2〇μL PCR反 应体系为：模板DNA 60 ng，Taq酶0.5 U，上、下游引物（5 μ mol· Γ1)各0.4 μ L，dNTP (10 mmol· 0 0.4 μ L，10 X PCR缓冲液2 μ L，用无菌超纯水补充反应体系至20 μ L。 PCR 反应程序为：先 94 °C 5 min;然后 94 °C 30 s，55°C 30 s，72°C I min，共 35 个循环； 最后 72 °C 5 min，4°C保存。
[0019] 然后按下述方法对PCR扩增产物进行10% (w/v)的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检 测：取20 μL扩增产物，加入4 μ L非变性载样指示剂（0.25% (w/v)溴酚蓝，0.25% (w/v) 二甲苯腈和40% (w/v)蔗糖)，每份扩增样品取3 yL在浓度为10%的非变性聚丙烯酰胺 凝胶中电泳分离， 银染显色。结果 14 个 EST-SSR 位点 Ptssr0083、Ptssr0019、Ptssr5649、Ptssr0085、 Ptssr2948、Ptssr0243、Ptssr0125、Ptssr5594、Ptssr0189、Ptssr0481、Ptssr0639、 Ptssr6542、Ptssr0182和Ptssr6386在213个菌株间有多态性，其中引物Ptssr0125检测 出了两种电泳带型，分称为带型A和B，所有菌株均能扩增出200bp的DNA片段，见图1中带 型A，生理小种THTS还可扩增出178bp的DNA片段，见图1中带型B。
[0020] 实施例1 : 1、 提取213个叶锈菌株的基因组DNA为模板； 2、 以Ptssr0125为引物、213个叶锈菌基因组DNA为模板，进行PCR扩增。20 μL PCR反 应体系为：模板 DNA 60 ng，Taq 酶 0.5 U，、下游引物（5 μ mol· Γ1)各 0.4 μ L，dNTP (10 mmol · 0 0.4 μ L，10 X PCR缓冲液2 μ L，用无菌超纯水补充反应体系至20 μ L。反 应程序为：先 94 °C 5 min;然后 35 个循环：94 °C 30 s，55°C 30 s，72°C I min;最后 72 °C 5 min，4°C保存。
[0021] 3、对扩增产物进行分离检测：在扩增产物中加入非变性载样指示剂，然后在浓度 为10% (w/v)的变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，银染显色，于聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 的PCR扩增图谱中，同时有200bp和178bp大小条带的为生理小种THTS，只有200bp大小条 带的为其它生理小种。
【主权项】
1. 一种用于鉴定小麦叶锈菌生理小种的引物序列，是由序列表中引物Ptssr0125的上 下游核苷酸序列组成的引物对。2. 权利要求1所述的引物序列在鉴定小麦叶锈菌生理小种中的应用。3. 根据权利要求2所述的引物序列在鉴定小麦叶锈菌生理小种中的应用，其特征在 于：以待测小麦叶锈菌菌株基因组DNA为模板，以引物Ptssr0125进行PCR扩增，再对扩增 产物进行检测；扩增产物含有200 bp条带，且含有178 bp条带时，则待测小麦叶锈菌的生 理小种类型为THTS。4. 根据权利要求3所述的引物序列在鉴定小麦叶锈菌生理小种中的应用，其特征在 于，所述的PCR扩增： 20ML PCR反应体系为：模板DNA 60 ng，Taq酶0.5 U，上、下游引物（5 ii mol 各 0. 4 iiL，dNTP (IOmmol^r1)O. 4 iiL，10 X PCR 缓冲液 2 iiL，用无菌超纯水补充反应 体系至20 ii L ; PCR 反应程序为：先 94 °C 5 min;然后 94 °C 30 s，55°C 30 s，72°C I min，共 35 个 循环；最后72 °C 5 min，4°C保存。5. 根据权利要求3或4所述的引物序列在鉴定小麦叶锈菌生理小种中的应用，其特征 在于，所述的对扩增产物进行检测是：对扩增产物在10% (w/v)的非变性聚丙烯酰胺凝胶 中电泳分离，银染显色。
【专利摘要】本发明公开了一种用于鉴定小麦叶锈菌生理小种THTS的引物应用及THTS小种特异DNA序列，所述引物序列是由序列表中引物Ptssr0125的上下游核苷酸序列组成的引物对。利用该EST-SSR分子标记可以对小麦叶锈菌进行快速的菌株生理小种鉴别。
【IPC分类】C12Q1/04, C12N15/11, C12Q1/68, C12R1/645
【公开号】CN104975073
【申请号】CN201410139689
【发明人】闫红飞, 张林亚, 杨文香, 刘大群
【申请人】河北农业大学
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2014年4月9日