用于鉴别小麦叶锈菌和杆锈菌的抗原及多克隆抗体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及用于鉴别小麦叶诱菌和杆诱菌的抗原及多克隆抗体，属于植物病害防 治领域。
【背景技术】
[0002] 小麦诱病（PucciniareconditaRob.e址esm.f.sp.triticiErikss.litHenn.)是由 小麦诱菌引致的真菌性病害，该病害是中国乃至全世界所有产麦国家的一类重要病害，严 重发生时会造成15%W上的产量损失。
[0003] 长期W来，小麦诱病的预测预报主要基于定期、大规模的田间病情调查和室内病 菌小种的活体分离、培养和鉴定。不仅耗时费工，而且其结果的准确性和可信度也在很大程 度上取决于调查测报人员的技术水平和经验，难W满足快速、高通量诊断检测的实际需求。 特别是在小麦叶诱菌的潜育阶段，寄主的发病症状不易观察，难W界定初侵染的时期和规 模。因此，有必要利用现代生物技术，研发简单易行、灵敏准确的小麦叶诱菌快速诊断和检 测手段。
【发明内容】
[0004] 为满足上述领域的需求，本发明提供一种用于检测小麦叶诱菌的抗原W及多克隆 抗体。
[0005] 本发明请求保护的技术方案如下：
[0006] 一种用于制备区分小麦叶诱菌和小麦杆诱菌的多克隆抗体的抗原多肤，其氨基酸 序列如沈QIDNO:1所示。
[0007] -种用于制备区分小麦叶诱菌和小麦杆诱菌的多克隆抗体的免疫原，其特征在 于，W权利要求1所述的抗原多肤为半抗原制备而得。
[0008] 所述免疫原的制备方法是：取权利要求1所述的抗原多肤6mg，用ImLDMF溶解， 得到溶液A;取15mgEDC和畑S，用0. 2血閒5. 0MES充分溶解后，加入溶液A中，室溫下 揽拌2地，即可得到反应液B;称取牛血清白蛋白BSA50mg，使之充分溶解在3.8血0. 1M PH7. 2PBS中，将反应液B逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下揽拌2地，在4°C下，用 0.Olmol/LPBS透析3天，每天换3次透析液；分装，保存于-20°C备用。
[0009]用于区分小麦叶诱菌和小麦杆诱菌的多克隆抗体，其特征在于，W权利要求2或3 所述的免疫原对家兔进行免疫制备而得。
[0010] 权利要求4所述的多克隆抗体的制备方法，步骤如下：
[0011] (1)W权利要求2或3所述的免疫原免疫家兔，检测筛选高效价的免疫家兔；
[0012] (2)对选中的家兔采取全血，纯化获得多克隆抗体。
[0013] 所述免疫家兔的免疫次数为7次，所述检测筛选免疫的家兔指采用elisa方法对 诱菌抗原检测效价达到2WW上的免疫家兔。
[0014] 权利要求4所述的多克隆抗体在区分小麦叶诱菌和小麦杆诱菌中的应用，其特征 在于，用权利要求4所述的多克隆抗体与待测样品进行反应，观察反应结果，若为阴性，贝U所述样品为小麦叶诱菌。
[0015] 所述反应包括Elisa,Western-blot,免疫巧光试验。
[0016] 本发明对小麦叶诱菌特有蛋白（HAD-supe;rfamilysubfamilyIIAhy化olase，其 氨基酸序列如SEQIDNO:2所示）进行二级结构、免疫原性、亲疏水性等特性进行分析，选 择了其中一段，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，人工合成。
[0017] 将人工合成的抗原多肤与BSA偶联制备免疫原。
[0018] 采用获得的免疫原免疫家兔，多次免疫经效价检测，选择效价达到理想值的家兔， 收集其抗血清。用蛋白纯化柱纯化抗血清获得多克隆抗体。
[0019] 对纯化后的抗体进行竞争免疫抑制试验，试验结果显示，获得的多克隆抗体与天 然杆诱菌抱子进行免疫反应为阳性，与天然叶诱菌抱子进行免疫反应为阴性。
[0020] 本发明用于区分小麦叶诱菌和小麦杆诱菌的方法，操作十分简便，只需取诱菌抱 子与本发明抗体在适当的反应条件下进行反应，如果出现阳性反应，则该样品是小麦杆诱 菌。整个过程无需仪器，技术人员可W携带相关试剂和耗材，在野外就能完成两种诱病的鉴 另IJ，能够简便有效地检测是否发生叶诱菌早期感染。
【附图说明】
[0021] 图1.多克隆抗体的制备流程图，
[0022] 免疫时间安排：如表2所示，初次免疫15天后进行第二次免疫，15天后进行第Ξ 次免疫，7天后第一次采血检测，7天后进行第四次免疫，7天后第二次采血检测，7天后进行 第五次免疫，7天后第Ξ次采血检测，W此类推，每组均完成至少6次免疫与4次采血检测。 其中，E004组的实验兔子免疫效果较好，为本次实验的优选组，其免疫时间安排如表3所 /J、-〇
[0023] 图2.纯化所得的多克隆抗体检测图，
[0024] 从左至右依次为：Marker、血清样、纯化样，上样量约10微克/孔，抗体大小在 150kDa~ISOkDa之间。
【具体实施方式】
[00巧]下面通过具体实施例对本发明作进一步详细说明，需要理解的是，下述实施例仅 作为解释和说明，而不W任何形式限制本发明的保护范围。
[0026] 表1本实施例所用菌种
[0027]
[0028]W下实施例中未特别说明的生物化学试剂均为本领域常规试剂，可W通过本领域 常规方法配制而得或商购获得，规格为实验室纯级即可。
[0029] 实施例1.用于鉴别杆诱菌的多克隆抗体制备
[0030] 试剂与溶液：
[0031] 弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂（北京勤邦生物技术有限公司）
[0032]憐酸盐缓冲液（PBS，0. 02M，pH7. 2)，
[0033]包被液（憐酸盐缓冲液，0. 05M，pH7. 4)，
[0034]反应稀释液任851'，抑7.4,0.031，+0.05%吐溫20)，
[0035] 洗涂工作液（用去离子水将20X浓缩洗涂液按1 :19体积比进行稀释）；
[0036]封闭液（在 0. 02mol/LPBST中加入 0. 05%BSA)，
[0037] 底物显色液：由A液和B液组成，A液为过氧化氨，B液为四甲基联苯胺；
[0038]终止液（2mol/LH2SO4)，
[0039] 酶标二抗（北京勤邦生物）：辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IGg抗体
[0040] 表1所示的4种诱菌，每种诱菌的悬液1*1〇5抱子/ml
[0041] 主要仪器设备：
[0042] 真空冷冻干燥机，电热恒溫培养箱，ProteinA/G柱，电泳槽、电泳仪，酶标板，酶标 仪，低溫高速离屯、机，ProteinA层析柱等。
[0043] 实验动物：新西兰大耳兔，购自中国军事医学科学院。
[0044] 1、多肤合成
[0045]根据小麦叶诱菌特有蛋白（HAD-supe;rfamilysubfamilyIIAhy化olase)序列 佛QIDNO:
[0046] 2)设计多肤，筛选获得抗原多肤，其氨基酸序列为：CGVFKGNKPEDA，委托北京勤邦 生物技术有限公司对上述抗原蛋白进行化学合成，获得半抗原。
[0047] 2、免疫原和包被原制备
[0048] (1)半抗原与牛血清白蛋白度SA)偶联形成免疫原
[0049] 取步骤1获得的半抗原6mg，用1血DMF溶解，得到溶液A;取15mgEDC和畑S，用 0. 2血MES(P册.0)充分溶解后，加入溶液A中，室溫下揽拌2地，即可得到反应液B。称取牛 血清白蛋白BSA50mg，使之充分溶解在3.8血0. 1MPBS(PH7. 2)中，将反应液B逐滴缓慢 滴加到蛋白溶液中，并于室溫下揽拌2地，在4°C下，用0.Olmol/LPBS透析3d，每天换3次 透析液。分装，保存于-20°C备用。
[0050] (2)半抗原与卵清蛋白（OVA)偶联形成包被原
[005。取步骤1获得的半抗原4mg，用1血DMF溶解，得到溶液A;取2. 5 %的戊二醒 200ul，加入A溶液，反应30min即可得到反应液B。称取卵清蛋白50mg，使之充分溶解在 3.8mL0. 1MCB液中，将反应液B逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下揽拌16h，再加入 棚氨化钢还原反应2小时，然后在4°C下，用0.Olmol/LPBS透析3d，每天换3次透析液。分 装，保存于-20°C备用。
[0052] 3、多抗制备
[0053] 免疫原：将步骤2获得的免疫原，与弗氏完全佐剂按1:1体积比混匀后对实验兔子 进行初次免疫，W后每次免疫采用弗氏不完全佐剂与免疫原按1:1体积比混匀后进行。共 制备了 7个免疫原，分别进行免疫。
[0054] 免疫剂量：初次免疫0. 2mg/次/只，第二次开始0.1 mg/次/只。