专利名称：小麦黄矮病毒的多重pcr检测方法
技术领域：
本发明属于植物病毒学技术领域，特别是涉及小麦黄矮病毒的多重PCR检测方 法。
背景技术：
小麦是全世界最主要的粮食作物之一，我国的种植面积居世界首位。但是，病毒病 及其它病害严重影响了小麦的产量和质量。大麦黄矮病毒病(Barleyyellow dwarf virus, BYDV)是一种全球性的病毒病害。每年对世界粮食生产造成一定程度的危害，大发生时会 造成严重减产。在我国，该病主要流行于北方麦区，引起的小麦黄矮病是重要的流行病害。 1987年仅陕西和甘肃两省就因该病害的流行损失5亿多公斤小麦，1998年大面积流行发生 范围遍及陕西、山西、宁夏、内蒙和河北等多个省(自治区)。为了保证小麦生产的产量和质 量，准确鉴定小麦病害，了解其流行动态，以尽早做好防范措施。因此小麦生产上急需一种 较为灵敏、准确和快速的病害检测方法。早期的检测方生物学、血清学、电镜观察、核酸杂交和PCR技术都先后用于检测 小麦病毒，但是一些传统的检测方法灵敏度不是很高，而且都只针对单一病毒的检测，对多 种病毒混合检测时，需要耗费较多的时间和试剂。多重PCR(M-PCR)是在普通 PCR(polymerase chain reaction)的基础上加以改 进，于一个PCR反应体系中加入多对特异性引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域 扩增多个目的片段的PCR技术。与常规的单一 PCR相比，多重PCR可以同时检测多种病害， 极大地提高检测效率，降低检测成本。目前国内有单重和荧光PCR检测BYDV-PAV、GPV、GAV， 而在田间经常表现为多种病害复合侵染；并且其症状极其相似，需要用分子方法进行区分。 利用单一 PCR对多种病毒进行系统检测的工作量较大，因而多重RT-PCR在小麦病害的检测 中的优越性更为明显。
发明内容
本研究针对我国小麦病害发生的现状，利用设计的特异性引物对，摸索和优化多 重PCR反应体系的条件参数等，建立了能从小麦叶片组织中同时检测BYDV种群PAV、GPV, GAV三种病毒的复合侵染田间样品的多重PCR检测方法。具体的，本发明提供了一种利用多重PCR反应同时检测小麦黄矮病种群中PAV、 GPV、GAV三种病毒的方法，该方法包括小麦病毒总RNA的提取、逆转录反应制备cDNA模板， 多重PCR反应，电泳检测，确定病毒种类，其特征在于逆转录反应制备cDNA模板应用引物 SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 4 和 SEQ IDN0. 6，多重 PCR 反应中应用引物 SEQ ID N0. 1-6。SEQ ID NO. 1-6的核苷酸序列如下SEQ ID NO. 1 :5，-ATGAATTCAGTAGGCCGTAGG-3，(PAV F)SEQ ID N0. 2 5' -CTATTTGGCCGTCATCAAGTG-3，(PAV R)SEQ ID N0. 3 5' -GGTCGCCCTTAGAAATG-3，(GPV F)
SEQ ID NO. 4:5，-GCCTCGGTGATGAACTG-3，(CPV R)SEQ ID NO. 5 5' -GTAGAAATAACCGCAGGAG-3，(GAV F)SEQ ID N0.6 :5，-GACTTGAGTATTCCACCTGA-3，(GAV R)上述方法中，优选地，在多重PCR反应的反应体系中，缓冲液浓度为0.4 X-0.9 X ； dNTPs浓度为0. 1-0. 5mM ；Mg2+浓度为1. 0-3. 5mM ；退火温度为51-55°C ；循环次数为20-45 次；延伸时间为30-55s。上述方法中，优选地，多重PCR反应的反应体系中，缓冲液浓度为0.4X、0.5X、 0. 6X、0. 7X、0. 8X 或 0. 9X ；dNTPs 浓度为 0. lmM、0. 2mM、0. 3mM、0. 4mM 或 0. 5mM ；Mg2+浓度 为 1. OmMU. 5mM、2. OmM,2. 5mM、3. OmM 或 3. 5mM ；退火温度为 51°C、52°C、53°C、54°C或 55°C ； 循环次数为20、25、30、35、40或45次；延伸时间为30、35、40、45、50或55s。上述方法中，更加优选地，多重PCR反应的反应体系中，缓冲液浓度为0.8X或 0. 9 X，dNTPs浓度为0. 4mM或0. 5mM,Mg2+浓度为2. 5mM或3. 5mM,退火温度54°C，延伸时间 45s，循环次数30次。上述方法中，尤其优选地，多重PCR反应的反应体系中，TaqDNA聚合酶浓度为 0. 04U/ μ L-0. 06U/y L。上述方法中，尤其优选地，多重PCR反应的反应体系中，缓冲液浓度为0. 9Χ， dNTPs浓度为0. 4mM, Mg2+浓度为3. 5mM, Taq DNA聚合酶浓度为0. 06U/ μ L。上述方法中，多重PCR反应的反应体系中，3对引物之间的摩尔比例为 PAV GPV GAV = 2 1 1。应用本发明的多重PCR反应检测小麦黄矮病的方法对田间复合侵染的小麦材料 检测具有快速、省时、节约成本等优势。
图1是三种病毒单重PCR检测结果M =DNA分子量标准；1 健康小麦；2_4分别为 PAV, GPV, GAV感染的小麦图2是应用多重PCR对陕西各地区BYDVs种群的田间检测1 =DNA分子量标准；2 健康小麦；3-12 凤翔、眉县、长武、旬邑、彬县、杨凌、武功、周至、成阳、合阳和韩城感染黄 矮病的小麦。
具体实施例方式为了理解本发明，下面以实施例进一步说明本发明，但不限制本发明。引物的设计和合成根据BYDV-PAV株系杨凌分离物、GPV株系中国分离物、GAV株系中国分离物的外壳 蛋白基因序列、DNAMAN软件计算引物Tm值，选择Tm值较一致的各条引物，保证在同一个退 火温度下同时检测到PAV、GPV和GAV 3种病毒。通过Primer Primier 5. 0和Blast序列 比对方法对引物进行互补性测试，选择互补性最低的引物对，优化多重PCR的引物，核苷酸 序列为SEQ ID NO. 1-6，由南京思特公司合成。 单重PCR反应总RNA 提取小麦黄矮病株材采集自凤翔、眉县、长武、旬邑、彬县、杨凌、武功、周至、成阳、合阳 和韩城。分别称取PAV，GPV, GAV感染的小麦(分别标记为样品2、样品3、样品4)各0. Ig 于_80°C深冻研钵中，加液氮充分研磨，迅速转入到无RNase的无菌1. 5mL eppendof管中， 力口入 ImL BIOzol Extraction Reagent 混勾，放置 15min。力口入 0. 2mL 氣仿禾口 0. 3ml 苯酷溶 液上下倒置混勻，4°C 12000Xg离心15min。取上清液转入新印pendof管中，加入与上清 液等体积的异丙醇，振荡混勻，_20°C放置30min。4°C 12000Xg离心15min，弃上清液。用 ImL 75%乙醇(DEPC水配制)洗涤沉淀，4°C 12000 X g离心5min，弃上清液，自然干燥。加 入30 μ L DEPC水溶解沉淀。_80°C保存备用，获得3种病毒的总RNA，同时以健康烟草(标 记为样品1)总RNA为阴性对照，提取方法同上。RT 反应分别对每种病毒的总RNA进行逆转录反应。用M-MLV反转录酶反转录合成各病 毒cDNA第一链25yLRT反应体系如下2yL总RNA，lyL病毒引物(SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 4 和 SEQ ID NO. 6) (10 μ mol/L)，7 μ LDEPC-H2O, 70°C变性 5min，迅速置冰上 2min ；再加 入 5 μ L 5 X RT buffer, 5 μ LdNTP (各 2. 5mmol/L)，0· 5 μ LRNase 抑制剂(40U/ μ L)禾口 1 μ L M-MLV反转录酶(200U/ μ L)，离心后，42°C水浴lh，95°C灭活5min，置冰上待用，获得3种病 毒的cDNA。PCR 反应分别对每种病毒的cDNA进行PCR反应。25 μ LPCR标准反应体系14. 4 μ LddH20， 2. 4 μ LlO XPCR buffer [750mmol/LTris-HCl (pH8. 8), 200mmol/L, (NH4) 2S04,0. 1 % Tween 20], 2 μ L25mmol/L, MgCl2, 2 μ LdNTP (各 2. 5m mol/L)，1 μ L 上游和下游引物混合物(SEQ ID Ν0. 1-6)(各 10 μ mol/L)，0· 2 μ LTaq DNA 聚合酶(5U/ μ L)禾口 2 μ LcDNA 模板。PCR 反应循 环参数94°C预变性3min ；94°C变性30s，48°C退火30s，72°C延伸lmin，循环30次；72°C终 止补偿延伸IOmin。取5 μ LPCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分析比较。电泳检测取5 μ L PCR反应产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，在0. 5 X TAE缓冲液环境中，110V 稳压电泳40min，然后用凝胶成像系统观察并记录结果，分别得到3条特异性条带，得到每 种病毒的扩增引物条带位置，参见说明书附图中的图1。多重PCR反应
将RT产物作为多重PCR反应的模板，各BYDV特异性引物(SEQ IDN0. 1-6)同时加 入一个离心管中进行PCR反应。25 μ L反应体系的梯度设计，缓冲液浓度为0. 9 X，dNTPs浓 度为0. 4mM, Mg2+浓度为3. 5mM, Taq DNA聚合酶浓度为0. 06U/ μ L，退火温度54°C，延伸时 间45s，循环次数30次。3对引物之间的比例为PAV GPV GAV = 2 1 1PCR反应产物的纯化(1)电泳检测PCR产物，紫外切割目标条带；(2)将切割的凝胶装入一个预先称量好的干净1. 5ml离心管后，称重。(3)加相当于两倍体积凝胶的结合液DB (0. Ig凝胶相当于100 μ L溶液)。(4)将上述装有溶液的离心管放入56°C水浴，至胶完全溶解。每1-2分钟振荡一 次以加速溶解。(5)溶化后的凝胶溶液慢慢加入吸附柱AC中(吸附柱放入收集管中)，离心 12000rpm, lmin,弃滤液。如过凝胶总体积超过750 μ L，可分两次将溶液加入同一个吸附柱 AC中，中间重复离心一次。(6)加入700 μ L预先处理好的漂洗液WB于吸附柱AC中，离心12000rpm，lmin，弃滤液。(7)将吸附柱AC放回空离心管中，空离12000rpm，2min。(8)将吸附柱AC放入干净的离心管中，慢慢加入预先预热的30 μ 1洗脱缓冲液 EB,室温静置 2min，离心 12000rpm，lmin。连接、转化和筛选将纯化的目标片段与pMD18-T simple vector进行连接，在PCR管中加入5. 5 μ 1 的 PCR 纯化产物，0. 5μ L 的pMD18-T vector, 6 μ 1 的 solution 后，16°C Ih 或 4°C 过夜连接。 转化感受态大肠杆菌E. Coli JM109病筛选。CaCl2法制备感受态大肠杆菌，转化和筛选方 法如下(1)取_70°C保存的感受态细胞置于冰上融化，加入10 μ L连接产物，冰浴30min。(2)放入42°C水浴热激90sec后，立即置于冰上数分钟。(3)加入预冷的液体LB培养液900 μ L，37°C摇床低速培养lh。(4)室温下8000 Xg离心0. 5min，吸去上清至剩余200 μ L，用移液器将沉淀轻轻悬浮。(5)将悬浮液100 μ L均勻涂布在含50-100mg/mL Amp的LB平板(预先涂布4 μ L 200mg/mL IPTG和40 μ L 20mg/mL的Χ-gal)上，先于37°C将平板正放30min。然后倒置培 养 10-14h。(6)筛选白色单菌落置3mL含50_100mg/mL Amp的LB培养液中，37°C培养8_12h。重组质粒DNA的少量提取经过PCR鉴定为阳性克隆的菌液扩繁后，进行重组质粒的提取(1)取4. 5ml已扩繁菌液进行离心9000rpm，30s,弃上清，收集菌体。(2)加入250 μ 1溶液Pl (第(1)步)涡旋振荡至菌体沉淀彻底悬浮。(3)加入250 μ 1溶液Ρ2 (第(2)步)，温和地上下翻转6_10次，至菌液清亮。(4)加入400μ 1溶液Ρ3(第(3)步)，立即温和地翻转，13000rpm离心lOmin，取 上清。
(5)加入500μ 1溶液P4(第(4)步)于收集管上的吸附柱内，13000rpm常温离心 lmin，弃滤液进行平衡；将步骤(4)的上清液加入带有收集管的吸附柱AC中，13000rpm常 温离心lOmin，弃滤液。(6)加入500μ 1去蛋白液PE于AC管中，13000rpm离心lmin，弃滤液。(7)加入500 μ 1已预先处理的漂洗液WB，13000rpm离心lmin，弃滤液。(8)重复步骤(7) 一次。空柱13000rpm离心2min。(9)加入60_10(^1洗脱缓冲液冊于吸附柱内，静置11^11，13000印111离心11^11洗 脱DNA，-20°C保存备用。重组质粒鉴定，目的片段的测定和同源性分析对重组质粒进行PCR检测，将含有目标片段的阳性重组质粒寄送南京金思特生物 技术有限公司测序。根据序列测定结果，在GenBank中用BLAST搜索同原序列，进行同源性 分析。测序结果表明，PAV、GPV和GAV的扩增产物分别由600、342、274bp，与设计的PCR 产物大小相同。所得序列与参考序列的同源率分别达到99. 24%、100%和100%。证明了 多重PCR检测结果的可靠性。利用多重PCR对陕西田间采集样品进行检测，得出病毒侵染在田间的不同组合 (图2)。在杨凌的标样中检测出PAV、GPV和GAV，这证明多重PCR体系完全可以用于BYDV 三种病毒种的检测，田间确实存在三种病毒的混合侵染，也说明了多重PCR可以快速灵敏 的检测低浓度的病毒存在。本发明的方法已经通过具体的实施例进行了描述。本领域技术人员可以借鉴本发 明的内容适当改变原料、工艺条件等环节来实现相应的其它目的，其相关改变都没有脱离 本发明的内容，所有类似的替换和改动对于本领域技术人员来说是显而易见的，都被视为 包括在本发明的范围之内。
权利要求
一种利用多重PCR反应同时检测小麦黄矮病种群中PAV、GPV、GAV三种病毒的方法，该方法包括小麦病毒总RNA的提取、逆转录反应制备cDNA模板，多重PCR反应，电泳检测，确定病毒种类，其特征在于逆转录反应制备cDNA模板应用引物SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6，多重PCR反应中应用引物SEQ ID NO.1 6，多重PCR反应的反应体系中，缓冲液浓度为0.4× 0.9×；dNTPs浓度为0.1 0.5mM；Mg2+浓度为1.0 3.5mM；退火温度为51 55℃；循环次数为20 45次；延伸时间为30 55s。
2.根据权利要求1所述的方法，其中多重PCR反应的反应体系中，缓冲液浓度为0.8X 或0. 9 X，dNTPs浓度为0. 4mM或0. 5mM, Mg2+浓度为2. 5mM或3. 5mM,退火温度54°C，延伸 时间45s，循环次数30次。
3.根据权利要求1所述的方法，多重PCR反应的反应体系中，TaqDNA聚合酶浓度为 0. 04U/ μ L-0. 06U/y L。
4.根据权利要求1所述的方法，多重PCR反应的反应体系中，缓冲液浓度为0.9Χ， dNTPs浓度为0. 4mM, Mg2+浓度为3. 5mM, Taq DNA聚合酶浓度为0. 06U/ μ L。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中多重PCR反应的反应体系中，3对引物之 间的摩尔比例为PAV GPV GAV = 2 1 1。
全文摘要
本发明涉及小麦黄矮病毒的多重PCR检测方法，该方法包括小麦病毒总RNA的提取、逆转录反应制备cDNA模板，多重PCR反应，电泳检测，确定病毒种类，其中逆转录反应制备cDNA模板应用引物SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.6，多重PCR反应中应用引物SEQ ID NO.1-6。应用本发明的多重PCR检测小麦黄矮病的方法对田间复合侵染的小麦材料检测具有快速、省时、节约成本等优势。
文档编号C12Q1/68GK101921876SQ20101026764
公开日2010年12月22日 申请日期2010年8月31日 优先权日2010年8月31日
发明者吴云锋, 杨洋 申请人:西北农林科技大学